Funcionalización de nanofibras bacterianas para la presentación de péptidos elicitores de la respuesta inmune innata en plantas

Abstract

Las plantas son organismos sésiles capaces de reconocer estructuras altamente conservadas entre diferentes patógenos, tales como la flagelina o el factor de elongación EF-Tu. Estas estructuras reciben el nombre de patrones moleculares asociados a patógenos y son reconocidos por la planta a través de receptores específicos de reconocimiento de patrones. Dicho reconocimiento da lugar a una respuesta de defensa innata o basal que incluye la producción de especies reactivas de oxígeno y que restringe el crecimiento de los patógenos en las inmediaciones de la zona infectada. La utilización de los péptidos elicitores de la respuesta inmune flg22 y elf18, derivados de la flagelina y del EF-Tu respectivamente, se han propuesto como una estrategia alternativa o complementaria al uso de antimicrobianos y productos fitosanitarios en el campo de las ciencias agrarias, pero su uso con fines terapéuticos se ha visto limitado por el elevado coste de síntesis y su reducida vida media. Con el fin de mejorar la estabilidad de los péptidos elicitores, favorecer su interacción con la planta y reducir el coste de producción, en este trabajo fin de máster, en primer lugar, se ha ingenierizado genéticamente una cepa de E. coli para desarrollar un sistema de presentación de péptidos elicitores basado en la utilización de nanofibras de CsgA fusionadas a flg22 y elf18, con estructura amiloide. Dichas nanofibras son agregados polipeptídicos con una estructura tridimensional extremadamente estable. En segundo lugar, se ha puesto a punto el procedimiento de producción y purificación de las nanofibras funcionalizadas. Por último y para comprobar la capacidad elicitora de las fibras, se ha determinado la producción de especies reactivas de oxígeno por la planta tras su exposición a las fibras CsgA::flg22 y CsgA::elf18. Los resultados han demostrado que dichas fibras no son capaces de inducir la producción de especies reactivas de oxígeno y sugieren que las fibras de CsgA funcionalizadas con péptidos elicitores no constituyen una alternativa al empleo de péptidos sintéticos como inductores de la respuesta inmune de la planta

Plants are sessile organisms that are able to recognize highly conserved structures amongst different pathogens, such as flagellin or the elongation Factor Tu. These structures are called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and are recognised by the plant through specific pattern recognition receptors (PRRs). This recognition leads to an innate immune defence response that includes the production of reactive oxygen species and that restricts the growth of pathogens around the infected area. The use of flg22 and elf18 immune response-eliciting peptides (derived from flagellin and EF-Tu, respectively) has been proposed as an alternative or complementary strategy to the use of antimicrobial agents and phytosanitary products in the field of agricultural sciences, although their use for therapeutic purposes has been restricted due to their high cost of synthesis and short half-life. With the aim of improving the peptide stability, enabling plant interaction and reducing cost production, in this Master's thesis, firstly, a strain of E. coli was genetically engineered in order to develop a system to present elicitor peptides, based on the production of CsgA nanofibers fused to flg22 and elf18 peptides, with an amyloid structure. Such nanofibers are polypeptide aggregates with an extremely stable three-dimensional structure. Secondly, a protocol of production and purification of functionalised nanofibers was established. Finally and with the aim of checking the eliciting capacity of the fibres, the production of reactive oxygen species by the plant, following the exposure to CsgA::flg22 and CsgA::elf18 fibres, was determined. Results showed that such fibers are not capable of inducing the production of reactive oxygen species, and suggest that functionalised CsgA fibers with elicitor peptides are not an alternative to the use of synthetic peptides as inducers of the plant immune response