Novel application of bioassays and functional importance of minor crystal components of Bacillus thuringiensis serovar israelensis for dipteran pests

Abstract

Bacillus thuringiensis (Berliner, 1915) (Bt) es una bacteria Gram-positiva de forma redondeada que tiene la capacidad de formar esporas de resistencia. Bajo condiciones desfavorables, la bacteria esporula produciendo la espora y el cristal paraesporal. Este cristal está compuesto principalmente por una o más proteínas insecticidas, también llamadas δ-endotoxinas, las cuales son capaces de formar inclusiones cristalinas. Los insecticidas basados en Bt representan alrededor del 80% de todos los bio-plaguicidas existentes en el mercado. La toxicidad específica de las proteínas del cristal contra insectos diana es la base para el empleo de Bt como bioplaguicida en agricultura, selvicultura y control de mosquitos desde 1961. Actualmente la alternativa más importante para el control de larvas de mosquito y mosca se basa en toxinas producidas por B. thuringiensis ser. israelensis (Bti). Son necesarios métodos de bioensayo simples y reproducibles para evaluar la toxicidad de nuevos compuestos insecticidas para el manejo de plagas y para determinar la presencia de resistencias en poblaciones plaga. Hemos utilizado un isótopo radioactivo basado en 32P-ATP para estimar el volumen ingerido por dos plagas de dípteros: Ceratitis capitata (Tephritidae) y Drosophila suzukii (Drosophilidae). Utilizando un colorante azul en el tratamiento, fue posible distinguir individuos que habían ingerido la solución de aquellos que no lo había hecho. El volumen medio ingerido por adultos de C. capitata fue 1.968 μl. Las hembras ingirieron aproximadamente un 20% más de volumen que los machos. Los adultos de D. suzukii ingirieron una media de 0.879 μl, ingiriendo las hembras aproximadamente un ⁓30% más que los machos. El método de la gota fue validado utilizando como ingrediente activo (i.a.) el plaguicida de origen natural spinosad. En C. capitata, la respuesta concentración-mortalidad no varió entre sexos, ni entre tres lotes distintos de insectos. Los valores de dosis letal fueron calculados basándonos en el volumen medio ingerido. En C. capitata los valores de LD50 fueron 1.462 and 1.502 ng i.a./insecto para machos y hembras respectivamente. Cuando se consideró la variación específica del peso corporal dependiente de sexo, obtuvimos valores de 0.274 and 0.271 ng i.a./mg para machos y hembras respectivamente. Empleamos el mismo método para determinar los valores de D. suzukii. Esta técnica puede ser directamente empleada para determinar los estados de resistencia y la respuesta dosis-mortalidad de un compuesto insecticida en muchas especies de dípteros plaga. Bacillus thuringiensis ser. israelensis (Bti) forma cuerpos de inclusión paraesporales con forma semiesférica compuestos de proteínas insecticidas, representadas principalmente por cinco familias (Cry4, Cry10, Cry11, Cyt1 and Cyt2), los cuales son ampliamente utilizados como larvicidas microbianos frente a plagas de dípteros. La actividad insecticida del cristal completo es alta si se compara con las actividades de las proteínas individuales, probablemente debido a las interacciones sinérgicas que existen entre las distintas proteínas del cristal, especialmente aquellas que involucran a Cyt1Aa. En este estudio se clonaron Cry10Aa y Cyt2Ba a partir del producto comercial con actividad larvicida VectoBac® 12AS y se expresaron en la cepa de Bt acristalófora BMB171. Estas proteínas mostraron valores de LC50 de 299.62 y 279.37 ng/ml, respectivamente, frente a larvas de segundo estadio de A. aegypti, pero no mostraron actividad tóxica frente a adultos de C. capitata. Cuando las larvas de A. aegypti ingirieron una mezcla equitativa (ratio 1:1) de esporas y cristales de las proteínas recombinantes Cry10Aa y Cyt2Ba, se observó una fuerte actividad sinérgica. Se estimó que la magnitud de este efecto sinérgico fue de 34.3, encontrándose entre los valores más altos descritos hasta el momento para los componentes del cristal de Bti, y comparable a los publicados previamente para Cyt1A con Cry4A y Cry11A. Por lo tanto, los componentes minoritarios de Bti tienen una relevancia en la toxicidad global de la cepa y ambas proteínas pueden desempeñar un papel importante en la sinergia y en la prevención de la aparición de resistencias.

Bacillus thuringiensis (Berliner, 1915) (Bt) is a Gram-positive rod-shaped bacterium with the capacity to form resistance spores. Under unfavourable conditions, the bacterium sporulates producing the spore and the parasporal body. The latter is primarily composed by one or more insecticidal proteins, also called δ-endotoxins, which are able to form crystalline inclusions. Bt-based insecticides represent around 80% of all biopesticides in the market. The specific toxicity of crystal proteins against target insects is the basis for the use of Bt as a biopesticide in agriculture, forestry and mosquito control since 1961. Currently, the major alternative for mosquito and blackfly larval control is based on bacterial toxins produced by B. thuringiensis ser. israelensis (Bti). Simple and repeatable bioassay methods are required to evaluate the toxicity of novel insecticidal compounds for pest management and to determine the presence of resistance traits in pest populations. We used a radioactive tracer based on 32P-ATP to estimate the volume ingested by two dipteran pests: Ceratitis capitata (Tephritidae) and Drosophila suzukii (Drosophilidae). Using blue food dye it was possible to distinguish between individuals that ingested the solution from those that did not. The average volume ingested by C. capitata adults was 1.968 μl. Females ingested a ~20% greater volume of solution than males. Adults of D. suzukii ingested an average of 0.879 and females ingested ~30% greater than males. The droplet feeding method was validated using the naturally-derived insecticide spinosad as the active ingredient (a.i.). For C. capitata, the concentration-mortality response did not differ between the sexes or among three different batches of insects. Lethal dose values were calculated based on mean ingested volumes. For C. capitata LD50 values were 1.462 and 1.502 ng a.i./insect for males and females, respectively, equivalent to 0.274 and 0.271 ng a.i./mg for males and females respectively, when sex-specific variation in body weight was considered. We use the same process for determining the D. suzukii values. This technique could be readily employed for determination of the resistance status and dose-mortality responses of insecticidal compounds in many species of dipteran pests. B. thuringiensis ser. israelensis forms semi-spherical parasporal inclusion bodies composed of insecticidal proteins, mainly represented by five families (Cry4, Cry10, Cry11, Cyt1 and Cyt2), which are widely used as the basis for microbial larvicides against several dipteran pests. The insecticidal activity of the crystal is high in comparison to the activities of the individual toxins, which is likely due to synergistic interactions among the crystal proteins, particularly those involving Cyt1Aa. In the present study Cry10Aa and Cyt2Ba were cloned from the commercial larvicide VectoBac® 12AS and expressed in the acrystalliferous Bt strain BMB171. These proteins had LC50 values of 299.62 and 279.37 ng/ml, respectively, against A. aegypti second instars but did not show toxic activity against C .capitata adults. When the A. aegypti larvae ingested an equitable mixture (ratio 1:1) of spores and crystals of the Cry10A and Cyt2B recombinant proteins, a strong synergistic activity was observed. It was estimated that the magnitude of this synergistic effect was 34.3, which is among the highest values described so far for the components of the Bti crystal and comparable to those previously reported for Cyt1A with Cry4 and Cry11A. Therefore, Bti minor components have relevance in the overall toxicity of the strain and both proteins can play an important role in synergy and resistance avoidance.