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Publication Open Access Amine oxidases in the oxidative pathway of polyamines in Medicago truncatula grown under different nitrogen sources(2018) Urra Rodríguez, Marina; Morán Juez, José Fernando; Royo Castillejo, Beatriz; Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos; Nekazaritza Ingeniarien Goi Mailako Eskola TeknikoaCrop productivity relies heavily on fertilization. However, the augmented use of fertilizers by industrial farming results in an over-accumulation of nutrients in the soil, which induces nutritional stresses. The utilization of nitrate, ammonium, and urea as nitrogen sources leads to an elevated intracellular accumulation of ammonium, which makes indispensable to understand and elucidate the mechanism by which plants face ammonium toxicity. Early studies on plant metabolism of polyamines pointed to their involvement in responses to different environmental stresses. However, the precise mechanisms by which polyamines control plant responses to stress stimuli have not been elucidated yet. Previous results of our laboratory suggested the importance of the “urea cycle” on the tolerance of Medicago truncatula seedlings to ammonium, in which polyamine catabolism might play a key role in such tolerance, but there are still important gaps to fulfill. The excess of ammonium originated either from ammonium nutrition or from polyamine metabolism may be suggested to act as a feedback inhibitor of amine oxidases since polyamines, mainly putrescine, were accumulated while the content of γaminobutyric acid decreased. In the present study, an intra- and interspecific phylogenetic analyses of amine oxidases are performed in order to characterize them. Moreover, the differential effect of distinct nitrogen nutrition and doses on diamine oxidases and polyamine oxidases activities involved in the catabolic processes of polyamines in connection to the “urea cycle” was assayed. In general terms, the results obtained in this study showed higher diamine oxidase activities in Medicago truncatula plant shoots than that observed in roots. In addition, plants supplied with low dose of ammonium exhibited significantly higher diamine oxidase activity in shoots in comparison with nitrate- and urea-fed plants, whereas diamine oxidase activity was significantly higher in roots of ammonium-fed plants at high dose. Since diamine oxidase activity has been shown to be increased under ammonium conditions in Medicago truncatula tissues, this might suggest the importance of polyamine catabolism in the tolerance against high ammonium conditions. Although alternative mechanisms underlying ammonium stress/tolerance response are proposed in this report, future research should be performed to elucidate the mechanisms underlying plant ammonium tolerance responses.Publication Open Access Both free indole-3-acetic acid and photosynthetic performance are important players in the response of Medicago truncatula to urea and ammonium nutrition under axenic conditions(Frontiers Media, 2016) Esteban Terradillos, Raquel; Royo Castillejo, Beatriz; Urarte Rodríguez, Estíbaliz; Zamarreño, Ángel M.; García Mina, José M.; Morán Juez, José Fernando; IdAB. Instituto de Agrobiotecnología / Agrobioteknologiako InstitutuaWe aimed to identify the early stress response and plant performance of Medicago truncatula growing in axenic medium with ammonium or urea as the sole source of nitrogen, with respect to nitrate-based nutrition. Biomass measurements, auxin content analyses, root system architecture (RSA) response analyses, and physiological parameters were determined. Both ammonium and ureic nutrition severely affected the RSA, resulting in changes in the main elongation rate, lateral root development, and insert position from the root base. The auxin content decreased in both urea- and ammonium-treated roots; however, only the ammonium-treated plants were affected at the shoot level. The analysis of chlorophyll a fluorescence transients showed that ammonium affected photosystem II, but urea did not impair photosynthetic activity. Superoxide dismutase isoenzymes in the plastids were moderately affected by urea and ammonium in the roots. Overall, our results showed that low N doses from different sources had no remarkable effects on M. truncatula, with the exception of the differential phenotypic root response. High doses of both ammonium and urea caused great changes in plant length, auxin contents and physiological measurements. Interesting correlations were found between the shoot auxin pool and both plant length and the “performance index” parameter, which is obtained from measurements of the kinetics of chlorophyll a fluorescence. Taken together, these data demonstrate that both the indole-3-acetic acid pool and performance index are important components of the response of M. truncatula under ammonium or urea as the sole N source.Publication Open Access The importance of the urea cycle and its relationships to polyamine metabolism during ammonium stress in Medicago truncatula(Oxford University Press, 2022) Urra Rodríguez, Marina; Buezo Bravo, Javier; Royo Castillejo, Beatriz; Cornejo Ibergallartu, Alfonso; López Gómez, Pedro; Cerdán Ruiz, Daniel; Esteban Terradillos, Raquel; Martínez Merino, Víctor; Gogorcena, Yolanda; Tavladoraki, Paraskevi; Morán Juez, José Fernando; Zientziak; Institute for Advanced Materials and Mathematics - INAMAT2; Institute for Multidisciplinary Research in Applied Biology - IMAB; Ciencias; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa; Gobierno de Navarra / Nafarroako GobernuarenThe ornithine–urea cycle (urea cycle) makes a signifcant contribution to the metabolic responses of lower photosynthetic eukaryotes to episodes of high nitrogen availability. In this study, we compared the role of the plant urea cycle and its relationships to polyamine metabolism in ammonium-fed and nitrate-fed Medicago truncatula plants. High ammonium resulted in the accumulation of ammonium and pathway intermediates, particularly glutamine, arginine, ornithine, and putrescine. Arginine decarboxylase activity was decreased in roots, suggesting that the ornithine decarboxylase-dependent production of putrescine was important in situations of ammonium stress. The activity of copper amine oxidase, which releases ammonium from putrescine, was signifcantly decreased in both shoots and roots. In addition, physiological concentrations of ammonium inhibited copper amine oxidase activity in in vitro assays, supporting the conclusion that high ammonium accumulation favors putrescine synthesis. Moreover, early supplementation of plants with putrescine avoided ammonium toxicity. The levels of transcripts encoding urea-cyclerelated proteins were increased and transcripts involved in polyamine catabolism were decreased under high ammonium concentrations. We conclude that the urea cycle and associated polyamine metabolism function as important protective mechanisms limiting ammonium toxicity in M. truncatula. These fndings demonstrate the relevance of the urea cycle to polyamine metabolism in higher plants.Publication Open Access An integrated view of changing nutrient availability in model species: the role of signaling in the plant response(2017) Royo Castillejo, Beatriz; Morán Juez, José Fernando; Esteban Terradillos, Raquel; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen ZientziakLas plantas tienen que hacer frente a situaciones cambiantes en cuanto a la disponibilidad de nutrientes, por ese motivo en la presente tesis se ha estudiado la respuesta de (i) Arabidopsis thaliana frente a la deficiencia de fósforo, y de (ii) Medicago truncatula expuesto a diferentes fuentes de N. En este sentido, la deficiencia de fosfato afecta al transporte de electrones mediado por el citocromo c en la cadena de transporte de electrones de la mitocondria, con lo que las plantas habitualmente aumentan el flujo de electrones a través de la oxidasa alternativa (AOX). Con el objetivo de discernir si esta respuesta está unida a un aumento en la producción de óxido rútrico (NO) bajo la deficiencia de fosfato, se crecieron axénicamente plántulas wild type (WT) y doble mutantes de la nitrato reductasa (nía) de Arabidopsis thaliana durante 15 día.s en un medio que conterúa una concentración de fosfato inorgánico de O ó 1 m vL La deficiencia de fosfato produjo un aumento de la producción de NO en las raíces WT, y a su vez también incrementó la cantidad de AOX así como la capacidad de consumir electrones de la vía alternativa en plántulas WT. Sin embargo, bajo el mismo tratamiento las mutantes nía no fueron capaces de estimular la producción de NO ni la expresión de la AOX, y como consecuencia se alteró el crecimiento de estas plántulas que exhibieron un fenotipo diferente. La adición de S nitrosoglutatión en el medio de cultivo sin fosfato, en cierto modo restituyó el fenotipo de los mutantes nia, al mismo tiempo que aumentó la capacidad respiratoria asociada a la AOX. De esta manera, se puede concluir que el NO es necesario para la inducción de la vía alternativa de respiración en situaciones en las que la disponibilidad del fosfato es limitada. En la segunda parte de esta tesis, mediante la utilización de condiciones axénicas se ha identificado la respuesta temprana así como el comportamiento de Medicago truncatuala frente a la utilización de amonio y urea como únicas fuentes de N en comparación con la nutrición nítrica. Tanto el amonio como la urea afectaron a la arquitectura radicular, observándose cambios en el ratio de crecimiento de la raíz principal, en el desarrollo de las raíces laterales, así como alternaciones en el punto de inserción de la raíz. El contenido de aminas disminuyó en raíces tratadas con amonio y urea, mientras que respecto a la parte aérea únicamente se vieron afectadas las plantas crecidas en amonio. El análisis de fluorescencia de la clorofila a mostró que mientras el aporte de amonio afectó al fotosistema II, la urea no perjudicó la actividad fotosintética. En raíces, tanto el amonio como la urea afectaron de forma moderada las isoenzimas plastidiales de la actividad superóxido dismutasa. Por otro lado, la exposición a bajas dosis (1m/M) de amonio y urea no tuvo efectos en el metabolismo ni en la señalización del N. Bajo estas condiciones, se observó una inducción de las acuaporinas así como cambios en el metabolismo de los fenilpropanoides de las raíces indicando que la absorción de N del medio por las plantas está mediada por un adecuado mecanismo de detección. Sin embargo, altas dosis (25mM) de N produjeron cambios moderados en las plantas pero no se observaron signos de toxicidad ni estrés nitro oxidativo. El contenido de aminoácidos libres y de ureidos se vio afectado a altas concentraciones de N, observándose como resultado un aumento en la producción de amidas así como la activación del ciclo GABA para compensar el exceso de N asimilado bajo nutrición amoniacal. Las raíces crecidas con amonio produjeron las mismas cantidades de NO que las raíces nítricas, indicando que dicho NO podría estar implicado en la respuesta de M. truncatula a altas concentraciones de amonio. En general, nuestros resultados indicaron que las distintas fuentes de N no tuvieron efectos remarcables en M. truncatula crecido a bajas dosis, con excepción de la distinta respuesta fenotípica encontrada en las raíces. En conjunto, estos datos demuestran que tanto el ácido 3-indolacético y el rendimiento fotosintético son componentes importantes en la respuesta de M. truncatula crecida con amonio o urea como fuentes exclusivas de N. Además, otras piezas clave en la tolerancia de M. truncatula frente a la nutrición con amonio y urea son la redistribución del N asimilado, la disponibilidad de un mecanismo de detección muy específico de la fuente de N a nivel de pared celular y membrana plasmática, así como el papel que el NO puede estar desempeñando.Publication Open Access Nitrato, amonio y urea afectan diferencialmente las vías de ureidos y el ciclo de la urea y evidencian la importancia de las poliaminas en respuesta al estrés por amonio(2017) Cerdán Ruiz, Daniel; Morán Juez, José Fernando; Royo Castillejo, Beatriz; Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos; Nekazaritza Ingeniarien Goi Mailako Eskola TeknikoaLas nutriciones exclusivamente amoniacales o ureicas se caracterizan por causar un estrés en la mayoría de las plantas, dando lugar a disminuciones del crecimiento. Por otra parte, en la familia de las leguminosas, existen mecanismos que, aparentemente, poseen la capacidad de aliviar este estrés, como puede ser la adición de azucares, el tamponado del pH del medio extracelular, el aumento de la irradiancia o la adición de pequeñas cantidades de nitrato como señalizador. En este estudio se evaluó la actuación de las vías de producción de ureidos y de poliaminas en condiciones de crecimiento con nitrato, amonio y urea como únicas fuentes de nitrógeno, a bajas (1 mM de N) y a altas concentraciones (25 mM de N). Los resultados de este trabajo demostraron una acumulación diferencial de ureidos y poliaminas según el tipo de nutrición nitrogenada, y se observó una mayor acumulación de ureidos con urea o amonio, y un bloqueo de la vía de síntesis de poliaminas desde el ciclo de la urea con amonio. Estos resultados son relacionados con los contenidos de aminoácidos implicados en las vías mencionadas. En este trabajo, se muestra la tolerancia de Medicago truncatula a las nutriciones amoniacal o ureica, y evidencia los mecanismos de tolerancia al estrés por amonio y urea. Entre estos mecanismos es de destacar la novedosa importancia del ciclo de la urea en plantas en la síntesis de poliaminasPublication Open Access Nitric oxide induces the alternative oxidase pathway in Arabidopsis seedlings deprived of inorganic phosphate(Oxford University Press, 2015) Royo Castillejo, Beatriz; Morán Juez, José Fernando; Ratcliffe, R. George; Gupta, Kapuganti J.; IdAB. Instituto de Agrobiotecnología / Agrobioteknologiako InstitutuaPhosphate starvation compromises electron flow through the cytochrome pathway of the mitochondrial electron transport chain, and plants commonly respond to phosphate deprivation by increasing flow through the alternative oxidase (AOX). To test whether this response is linked to the increase in nitric oxide (NO) production that also increases under phosphate starvation, Arabidopsis thaliana seedlings were grown for 15 d on media containing either 0 or 1mM inorganic phosphate. The effects of the phosphate supply on growth, the production of NO, respiration, the AOX level and the production of superoxide were compared for wild-type (WT) seedlings and the nitrate reductase double mutant nia. Phosphate deprivation increased NO production in WT roots, and the AOX level and the capacity of the alternative pathway to consume electrons in WT seedlings; whereas the same treatment failed to stimulate NO production and AOX expression in the nia mutant, and the plants had an altered growth phenotype. The NO donor S-nitrosoglutathione rescued the growth phenotype of the nia mutants under phosphate deprivation to some extent, and it also increased the respiratory capacity of AOX. It is concluded that NO is required for the induction of the AOX pathway when seedlings are grown under phosphate-limiting conditions.Publication Open Access The proteome of Medicago truncatula in response to ammonium and urea nutrition reveals the role of membrane proteins and enzymes of root lignification(Elsevier, 2019) Royo Castillejo, Beatriz; Esteban Terradillos, Raquel; Buezo Bravo, Javier; Santamaría Martínez, Enrique; Fernández Irigoyen, Joaquín; Becker, Dirk; Morán Juez, José Fernando; Zientziak; Institute for Multidisciplinary Research in Applied Biology - IMAB; Ciencias; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate PublikoaPlants differ widely in their growth and tolerance responses to ammonium and urea nutrition, while derived phenotypes seem markedly different from plants grown under nitrate supply. Plant responses to N sources are complex, and the traits involved remain unknown. This work reports a comprehensive and quantitative root proteomic study on the NH4+-tolerant legume Medicago truncatula grown under axenic conditions with either nitrate, NH4+ or urea supply as sole N source by using the iTRAQ method. Sixty-one different proteins among the three N sources were identified. Interestingly, among the proteomic responses, urea nutrition displayed greater similarity to nitrate than to ammonium nutrition. We found remarkable differences in membrane proteins that play roles in sensing the N form, and regulate the intracellular pH and the uptake of N. Also, several groups of proteins were differentially expressed in the C metabolism pathway involved in reorganizing N assimilation. In addition, enzymes related to phenylpropanoid metabolism, including the peroxidases POD2, POD6, POD7 and POD11, which were up-regulated under ammonium nutrition, contributed to the reinforcement of cell walls, as confirmed by specific staining of lignin. Thus, we identified cell wall lignification as an important tolerance mechanism of root cells associated with the stunted phenotype typical of plants grown under ammonium nutrition.