Dpto. Agronomía, Biotecnología y Alimentación - Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura Saila [desde mayo 2018 / 2018ko maiatzetik]

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http://hdl.handle.net/2454/29214

Véase además departamentos anteriores a mayo 2018 / Ikus, halaber, 2018ko maiatza baino lehenagoko sailak

Dpto. Ciencias del Medio Natural - Natura Ingurunearen Zientziak Saila

Dpto. Producción Agraria - Nekazaritza Ekoizpena Saila

Dpto. Tecnología de Alimentos - Elikagaien Teknologia Saila

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Caracterización agronómica y ampelográfica de la serie RG de portainjertos de vid y estudio de las implicaciones de la calidad de la conexión del injerto sobre el comportamiento de la planta
(2022) Marín Ederra, Diana; Santesteban García, Gonzaga; Torres Molina, Nazareth; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
La llegada a Europa de la filoxera de la vid hacia el año 1868 supuso una de las mayores crisis agrícolas de la historia, siendo el uso de portainjertos americanos tolerantes la única solución exitosa para detener su avance. La ingente cantidad de plantas necesarias para reconstruir el viñedo europeo provocó el desarrollo del sector de los viveros, que desde entonces provee a los viticultores de material de plantación. Esta tesis doctoral aborda dos retos que en la actualidad preocupan en mayor medida al sector viverístico: (i) la optimización de la elección de portainjertos y (ii) la mejora de la calidad fisiológica de las plantas injerto producidas. Específicamente, el primer reto se ha acometido desde dos perspectivas, la necesidad de ampliar el conocimiento de la influencia que tienen los portainjertos convencionales sobre las distintas variedades en distintas condiciones y, en segundo lugar, el desarrollo de nuevos portainjertos adecuados para las condiciones mediterráneas. El segundo reto se ha abordado a través del estudio de las implicaciones que tiene el alineamiento de la púa y la estaca en el momento de injertado sobre la tasa de éxito en vivero y sobre el comportamiento posterior de la planta. En relación con el uso de portainjertos convencionales, durante 4 anualidades (2015-2018) se realizó el seguimiento agronómico de las variedades Syrah y Tempranillo injertadas sobre 12 portainjertos convencionales, en un viñedo típico del Valle del Ebro establecido por el vivero Vitis Navarra en la localidad de Miranda de Arga (Navarra). Se realizaron medidas de crecimiento, producción y composición de la uva en vendimia, observando un claro efecto del portainjerto en el comportamiento agronómico de ambas variedades, con un impacto relevante en los parámetros de crecimiento y rendimiento, afectando consecuentemente a la madurez. En cuanto al desarrollo de nuevos portainjertos, se llevó a cabo la caracterización agronómica de 8 nuevos híbridos de la serie RG, obtenidos de la primera generación de un cruce entre los portainjertos 41 B MGt y 110 R como resultado de un programa de hibridación llevado a cabo por el vivero Vitis Navarra. La evaluación se llevó a cabo en una parcela en la que se disponía de las variedades Syrah y Tempranillo injertadas sobre dichos híbridos. Durante cuatro anualidades (2016-2019) se realizaron medidas de crecimiento, producción y composición de la uva, demostrando que un programa de hibridación basado en un cruzamiento sencillo permite obtener nuevos híbridos con interés agronómico y comercial. Los trabajos realizados en esta tesis, junto con otros llevados a cabo por el vivero y otras entidades, han permitido identificar candidatos muy prometedores y han promovido el registro de alguno de ellos, aumentando la variabilidad disponible para el sector. Finalmente, en relación con el segundo reto planteado, en esta tesis doctoral se ha abordado el estudio de las implicaciones que tiene el alineamiento de la púa y la estaca sobre (i) el comportamiento de las plantas en vivero, (ii) sus primeros años de implantación en viñedo y (iii) sobre su comportamiento hídrico e hidráulico en un ensayo en macetas. Los resultados obtenidos han subrayado la importancia de implantar buenas prácticas en el momento de injertado que permitan un buen alineamiento entre los individuos. Así, las plantas con alineación completa aumentaron notablemente la tasa de éxito en vivero y mostraron crecimientos superiores, tanto en el vivero como en su primer año de establecimiento en viñedo comercial y en maceta, aunque estas diferencias fueron desapareciendo con el paso de los años. Las plantas con alineación completa entre la púa y la estaca también presentaron mayor nivel de intercambio gaseoso foliar en el ensayo en maceta, pero tales diferencias no se vieron reflejadas en las medidas de conductividad hidráulica a través del injerto. Los resultados obtenidos a lo largo de esta tesis doctoral han permitido profundizar el conocimiento de la nueva serie RG de portainjertos previo a su posible introducción en el mercado y poner en evidencia la importancia de un buen alineamiento entre la púa y la estaca a la hora de realizar el injerto.
Embargo
Designing novel interspecific baculovirus combinations for effective control of the soybean lepidopteran pest complex
(2025) Parras-Jurado, Ana; Caballero Murillo, Primitivo; Muñoz Labiano, Delia; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
La producción de soja se ve afectada significativamente por múltiples lepidópteros plaga que desarrollan rápidamente resistencia a productos químicos sintéticos, pesticidas bioracionales y cultivos transgénicos Bt. En este contexto, los baculovirus, particularmente los nucleopoliedrovirus (NPVs), ofrecen una alternativa efectiva, segura y sostenible para el control de plagas, algunas de las cuales se han utilizado con éxito como agentes de control biológico en la agricultura durante décadas. Sin embargo, su estrecho espectro de huéspedes limita su eficacia contra complejos de plagas en agroecosistemas como los cultivos de soja, donde los productores necesitan múltiples formulaciones basadas en baculovirus. La gran diversidad genética existente entre y dentro de los baculovirus ofrece una oportunidad para identificar variantes genotípicas de alto rendimiento. Esta tesis postuló que, al mezclar estratégicamente estos genotipos, se podrían controlar simultáneamente una amplia variedad de plagas de lepidópteros en la soja. La combinación de genotipos con fuertes propiedades insecticidas y diferentes especificidades de huéspedes podría simplificar la gestión de plagas, permitiendo a los agricultores controlar múltiples plagas con un solo producto y reduciendo la complejidad de las estrategias de gestión de plagas. Esta investigación comenzó con una revisión exhaustiva de las especies de lepidópteros plaga que causan pérdidas económicas en la soja, junto con los métodos de control actualmente utilizados contra ellas (Capítulo I). Se identificaron dos especies dentro de la familia Noctuidae como plagas clave en los cultivos de soja americanos: Anticarsia gemmatalis Hübner y Chrysodeixis includens Walker. Además, se consideraron varias otras noctuidas (específicamente, Rachiplusia nu Guenée, Helicoverpa armigera Hübner, Helicoverpa zea Boddie, Heliothis virescens Fabricius y varias especies dentro del género Spodoptera) como plagas secundarias. El trabajo experimental se inició con el análisis de las características insecticidas de cinco NPVs con amplio espectro de huéspedes (Capítulo II). Se seleccionó el aislado más patogénico, la cepa Anfa-C5B3 del NPV múltiple de Anagrapha falcifera (AnfaMNPV; Alphabaculovirus aucalifornicae), para una caracterización genotípica adicional. Se purificaron 30 genotipos mediante ensayo de placa y uno de ellos, Anfa-C, reveló propiedades insecticidas muy efectivas (en términos de patogenicidad, virulencia y producción de cuerpos de oclusión (OB)) contra una de las principales especies de lepidópteros plaga de la soja en América, C. includens, así como contra H. armigera, H. zea, S. exigua y T. ni. Estos hallazgos establecieron a Anfa-C como el primer candidato para una formulación compuesta basada en baculovirus. El siguiente análisis de cribado se centró en seleccionar un genotipo contra A. gemmatalis, una de las plagas clave en los cultivos de soja en América, que no era permisiva para Anfa-C (Capítulo III). Se caracterizaron tres aislados del NPV múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV, Alphabaculovirus angemmatalis). AgABB51, el aislado más patogénico y diverso genotípicamente, contenía 18 variantes genotípicas distintas, una de las cuales, Ag-M, mostró una alta actividad insecticida contra A. gemmatalis. Ag-M se convirtió así en el segundo candidato viral para formulaciones de virus mixtos. Para abordar las plagas de Spodoptera en los cultivos de soja, se llevó a cabo un análisis de cribado de NPVs específicos de Spodoptera (Capítulo IV). Una variante purificada por placa, Sf-GA, derivada del aislado Sf-G1 del NPV múltiple de Spodoptera frugiperda (SfMNPV, Alphabaculovirus spofrugiperdae), mostró la mayor eficacia en el control de las tres especies de Spodoptera. Así, Sf-GA fue identificado como otro candidato para el desarrollo de formulaciones de virus mixtos con un amplio espectro de huéspedes. Con los tres virus candidatos, se evaluaron dos mezclas equimolares interespecíficas de OBs, Anfa-C:Ag-M y Anfa-C:Sf-GA, contra seis especies de de lepidópteros plaga de la soja (Capítulo V). La mezcla Anfa-C:Ag-M amplió eficazmente el espectro de huéspedes de los genotipos individuales a cinco plagas, incluyendo A. gemmatalis, lo que la convierte en un candidato adecuado para los cultivos de soja americanos. La mezcla Anfa-C:Sf-GA proporcionó un control efectivo de las especies de Spodoptera, ofreciendo al mismo tiempo un espectro más amplio de huéspedes para gestionar varias plagas en los cultivos de soja fuera del continente americano.
Embargo
Estrategias nutricionales para reducir las emisiones de metano de origen entérico en vacuno lechero: utilización del quitosano y de la torta de lino prensada en frío
(2024) Rey Gotxi, Jagoba; García-Rodríguez, Aser; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
Las emisiones entéricas de metano plantean un problema grave para la producción de rumiantes y la sostenibilidad ambiental. Para mitigar las emisiones de metano, se han combinado esfuerzos de investigación en estrategias de manejo, alimentación y mejora genética de los animales. Sin embargo, para evaluar el efecto de cualquier estrategia nutricional sobre las emisiones entéricas de metano a nivel de granja es necesario implementar metodologías que permitan hacerlo. A partir de aquí, el objetivo general de esta tesis ha sido investigar diferentes estrategias nutricionales potencialmente capaces de reducir la producción de CH4 de origen entérico en vacas lecheras. Los objetivos específicos fueron: 1- comparar dos métodos no invasivos a gran escala para medir CH4: analizador de metano infrarrojo no dispersivo (NDIR) y el detector de metano láser portátil (LMD), 2- ampliar el conocimiento sobre la actividad y el modo de acción del CHI sobre la metanogénesis y las poblaciones microbianas del rumen in vivo y 3- describir los efectos de la suplementación dietética con torta de lino prensada en frío sobre los aspectos productivos, la metanogénesis y las poblaciones microbianas del rumen in vivo.
Embargo
Estudio de heterorresistencia antibiótica, regulación epigenómica e inactivación génica programable durante la infección respiratoria por Haemophilus influenzae
(2024) Gil Campillo, Celia; Garmendia García, Juncal; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
Este trabajo de Tesis Doctoral aborda tres aspectos clave en el estudio de la infección respiratoria por el patógeno oportunista Haemophilus influenzae, centrados en mecanismos alternativos a la resistencia antibiótica asociados al fallo terapeútico (Capítulo 1), la regulación epigenética de la expresión génica (Capítulo 2), y el desarrollo de herramientas de ingeniería genética innovadoras para estudios funcionales de genes bacterianos a escala genómica (Capítulo 3). H. influenzae está incluido en la Lista de Patógenos Prioritarios de la Organización Mundial de la Salud para los que el desarrollo de nuevos antimicrobianos se considera una prioridad sanitaria, en este caso debido a su resistencia creciente a ampicilina. Además de la resistencia, la heterorresistencia, tolerancia y persistencia antibiótica contribuyen al fallo terapéutico, y no son detectados mediante procedimientos estandarizados en la práctica clínica. El imipenem es un antibiótico carbapenémico útil en el tratamiento inicial-empírico de infecciones graves debido a su baja toxicidad y baja resistencia. La resistencia de H. influenzae a imipenen es poco frecuente, si bien la evidencia disponible sugiere que los niveles de heterorresistencia están infraestimados. En el Capítulo 1 de este Trabajo, evaluamos la resistencia, heterorresistencia y tolerancia a imipenem en una colección de cepas clínicas de H. influenzae aisladas de muestras respiratorias de pacientes que sufren Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC), y cuyos genomas habían sido previamente secuenciados. Mediante ensayos de tipo difusión en disco, Etest, TD-test y population analysis profiling identificamos un bajo nivel de resistencia, ausencia de tolerancia, y una proporción significativa de heterorresistencia a imipenem. Si bien buscamos rasgos genómicos responsables de la heterorresistencia observada mediante: i) análisis de la variación alélica de los genes ftsI, acrA, acrB y acrR, previamente asociados con heterorresistencia; ii) análisis de variación alélica a nivel genómico entre cepas pertenecientes al mismo tipo clonal pero fenotípicamente heterogéneas; y iii) análisis comparativo de distribución génica a nivel genómico en cepas susceptibles y heterorresistentes, no detectamos asociaciones significativas entre rasgos genéticos concretos y los fenotipos observados. En conjunto, mostramos que la heterorresistencia es un fenómeno con alta prevalencia, complejo y multifactorial, y destacamos la necesidad de implementar protocolos fáciles y rápidos para su identificación en la práctica clínica. Por otra parte, H. influenzae es una bacteria patobionte bien adaptada al ser humano, que provoca infecciones respiratorias en pacientes inmunocomprometidos que sufren, entre otras, EPOC. Los elementos reguladores que dictan la supervivencia y adaptación de H. influenzae en el pulmón de pacientes que sufren EPOC son poco conocidos. En γ-proteobacterias, el estado de metilación de motivos GATC localizados en regiones reguladoras modula la unión de la ARN polimerasa y de factores de transcripción, afectando la transcripción. En los genomas bacterianos, la mayoría de los motivos GATC se encuentran metilados por la metiltransferasa Dam, si bien existen sitios GATC que pueden permanecer no metilados o hemi-metilados si la actividad de Dam se encuentra bloqueada por la unión de proteínas al ADN. La combinación de motivos GATC metilados y hemi- o no metilados en regiones reguladoras o promotoras puede estar asociada a eventos de regulación epigenética de la expresión génica. En el Capítulo 2 de este Trabajo, analizamos la supervivencia de H. influenzae en un modelo pulmonar murino mediante mutagénesis por transposición a escala genómica acoplada a secuenciación profunda (Tn-seq), identificando la contribución de la metiltransferasa Dam en la supervivencia pulmonar de esta bacteria. El estudio del patrón de metilación por Dam a escala genómica mediante secuenciación en tiempo real de moléculas individuales (SMRT-sequencing), mostró motivos GATC no metilados o hemi-metilados en regiones reguladoras, lo que nos llevó a identificar el primer caso de variación fenotípica controlada por metilación Dam en una población de células isogénicas de H. influenzae. Además, la inactivación de dam y el estudio de su efecto a nivel transcriptómico, mediante secuenciación de ARN (RNA-seq) y análisis de expresión génica diferencial, reveló una nueva red regulatoria donde la metilación por Dam y los reguladores transcripcionales FNR y Fur regulan de manera coordinada la expresión de un panel de genes implicados en la defensa anaerobia de H. influenzae frente a especies reactivas de nitrógeno. Estos resultados tienen valor pato-adaptativo en nichos con estrés nitrosativo y baja oxigenación como son las vías respiratorias bajas de pacientes que sufren EPOC. Por último, H. influenzae fue el primer organismo de vida libre cuyo genoma completo fue secuenciado, siendo pionero en el desarrollo y empleo de técnologías -ómicas. Los métodos de secuenciación de inserción de transposones han sido útiles para realizar estudios de función génica e identificar genes esenciales en H. influenzae, si bien en su mayoría los genes que son considerados esenciales tienen funciones desconocidas dada la imposibilidad de generar mutantes. La tecnología de interferencia génica mediante CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat) acoplada a secuenciación profunda (CRISPRi-seq), solventa esta limitación permitiendo el escrutinio y análisis de genes esenciales a escala genómica mediante silenciamiento génico. En el Capítulo 3 de este Trabajo, desarrollamos una plataforma CRISPRi-seq inducible por anhidrotetraciclina para silenciamiento génico programable en H. influenzae a escala genómica, y validamos su utilidad y potencial, abriendo nuevas vías para la comprensión funcional del genoma de esta bacteria. En conjunto, el Trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral supone un avance significativo en el conocimiento de las bases moleculares de la infección por H. influenzae y presenta herramientas de ingeniería genética aplicables a la búsqueda de dianas terapeúticas para el desarrollo de estrategias que mejoren el manejo clínico de infecciones asociadas a este patógeno.
Embargo
Estudio de infección policlonal, vida extracelular y adaptación metabólica de Haemophilus influenzae en el sistema respiratorio humano
(2024) Asensio López, Javier; Garmendia García, Juncal; Burgui Erice, Saioa; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua
Este trabajo de Tesis Doctoral aborda tres aspectos de la interacción entre la bacteria Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano, considerando el desarrollo de herramientas genéticas de marcaje diferencial y su aplicación al estudio de infecciones policlonales (Capítulo 1), el potencial terapéutico anti-biofilm de moléculas derivadas de cinamaldehído (Capítulo 2), y el papel del triptófano y sus derivados en la modulación de la interacción hospedador-patógeno (Capítulo 3). Los procedimientos clínicos estandarizados para el tratamiento de infecciones bacterianas se basan en la identificación del patógeno causante y la determinación de su susceptibilidad antibiótica, a menudo utilizando bacterias aisladas a partir de una única colonia. En el caso de patógenos respiratorios, esta práctica puede ser cuestionable ya que los pacientes crónicos pueden estar simultáneamente colonizados por clones distintos de un mismo patógeno, con características genotípicas y fenotípicas diferentes que pueden conducir a diferentes perfiles de susceptibilidad antibiótica. Esta heterogeneidad es detectada en aislados de H. influenzae obtenidos a partir de muestras respiratorias de pacientes respiratorios crónicos, cuyos diferentes perfiles de susceptibilidad antibiótica pueden provocar fallo terapéutico en la práctica clínica. En el Capítulo 1 de este Trabajo, generamos una colección de plásmidos modulares que permiten el marcaje diferencial de cepas de H. influenzae. Empleando este marcaje diferencial, estudiamos la formación de biofilm mixtos formados por dos cepas de H. influenzae genéticamente distintas, con diferente capacidad de formación de biofilm y susceptibilidad antibiótica, mostrando la acción selectiva de los antibióticos en estos biofilms policlonales. Además, estudiamos la dinámica de co-infección epitelial por dos cepas de H. influenzae, mostrando la localización intracelular de cepas con distinta capacidad invasiva. Este panel de herramientas abre el camino al estudio de comunidades bacterianas policlonales y polimicrobianas en las que participa H. influenzae. Por otra parte, patologías respiratorias crónicas como la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) facilitan el acceso pulmonar de H. influenzae, que persiste formando biofilms, un estilo de vida protector frente al sistema inmune y tratamientos antibióticos, que cronifica la infección y facilita la aparición de resistencias. H. influenzae está incluido en la Lista de Patógenos Prioritarios de la Organización Mundial de la Salud por su resistencia a ampicilina, resultando prioritario el desarrollo de nuevos antimicrobianos y la estandarización de métodos de evaluación de eficacia de fármacos anti-biofilm. En el Capítulo 2 de este Trabajo, presentamos un panel de protocolos para el análisis sistemático de fármacos anti-biofilm. Como prueba de concepto, evaluamos el efecto antimicrobiano de moléculas derivadas del cinamaldehído frente a cepas de H. influenzae con distinta capacidad de formación de biofilm. Observamos que (E)-Trans-2- nonenal y (E)-3-Decen-2-ona inhiben la formación de biofilms y erradican biofilms preformados por H. influenzae. Además, la baja toxicidad de (E)-Trans-2-nonenal llevó a su selección para encapsulación en nanopartículas poliméricas, que permiten una mayor solubilidad manteniendo el efecto anti-biofilm, y pueden ser útiles para una liberación controlada y segura de fármacos. Por último, H. influenzae dispone de mecanismos pato-adaptativos entre los que se encuentra la evasión de la inmunidad nutricional. El triptófano (Trp) es un metabolito esencial para esta bacteria, que sintetiza su propio Trp y capta Trp exógeno a través de al menos dos sistemas de transporte. Por su parte, el hospedador restringe la disponibilidad de Trp a través de la acción de la enzima indolamina 2,3 dioxigenasa IDO, que cataboliza Trp generando kineurinas que, junto a otros derivados de Trp, son ligandos del receptor de hidrocarburos de arilos AhR. IDO y AhR participan en el control de la respuesta inmune y el mantenimiento de la homeostasis pulmonar. En el Capítulo 3 de este Trabajo, analizamos el efecto de la disponibilidad de Trp exógeno y endógeno en la fisiología e infección respiratoria por H. influenzae. Así mismo, analizamos cómo la disponibilidad de Trp en el sistema respiratorio influye en la interacción hospedador-patógeno, mostrando que el Trp y sus derivados modifican la expresión de IDO, AhR y sus efectores, modulando la respuesta del hospedador frente a la infección por H. influenzae. En conjunto, el Trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral supone un avance significativo en el conocimiento de las bases moleculares de la interacción entre H. influenzae y el sistema respiratorio humano, lo que puede ser de utilidad en el desarrollo de estrategias que mejoren el manejo clínico de enfermedades asociadas a este patógeno.
Open Access
Estudio del sistema Wzm/Wzt en Brucella y evaluación del candidato vacunal Rev1∆wzm frente a la brucelosis ovina
(2023) Mena Bueno, Sara; Grilló Dolset, María Jesús; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
La brucelosis es una enfermedad zoonótica causada por bacterias del género Brucella que, además, conlleva grandes pérdidas económicas. La principal fuente de infección para el ser humano son los rumiantes, en los que la enfermedad cursa con aborto y otras alteraciones reproductivas. En la mayoría de las regiones afectadas, la vacunación de los animales es la única estrategia realista para controlar la infección. La cepa atenuada B. melitensis Rev1 es la única vacuna recomendada frente a la brucelosis ovina y caprina, pero posee ciertos inconvenientes, entre los que destacan la virulencia en ovejas gestantes, la interferencia serológica que generan, la posibilidad de infectar al ser humano y la resistencia a los tratamientos con estreptomicina, que instan la búsqueda de nuevas vacunas. El lipopolisacárido liso (S-LPS) de Brucella es un conocido factor de virulencia y también el antígeno inmunodominante en las pruebas de diagnóstico, por lo que sus distintas modificaciones representan una interesante aproximación en la búsqueda de una vacuna segura. Entre las rutas de biosíntesis del S-LPS, el sistema de dos componentes Wzm/Wzt es el responsable de transportar el O-PS sintetizado en la cara citoplasmática de la membrana interna hasta el espacio periplasmático, para su posterior ensamblaje al core-lípido A para formar el S-LPS. El bloqueo de esta ruta conlleva la creación de mutantes con LPS rugoso (R-LPS) capaces de acumular un O-PS dentro de las bacterias que puede ser decisivo para generar una respuesta inmune efectiva frente a la infección. Sin embargo, aún se desconocen las implicaciones biológicas de cada proteína del transportador. En particular, el bloqueo del O-PS podría acarrear modificaciones en la envuelta bacteriana, ya que su transporte requiere la participación del bactoprenol como molécula portadora, el cual también está involucrado en la biosíntesis de otras estructuras celulares. Con el objetivo de profundizar en el conocimiento de este sistema transportador de Brucella y su potencial aplicación en el desarrollo de vacunas, en el capítulo 1 de esta tesis se presenta la construcción y caracterización de mutantes Δwzm/Δwzt simples y doble derivados de Rev1. Además, con fines comparativos, se construyeron mutantes ∆wzm derivados de B. abortus 2308 y S19, y se utilizó un mutante 16M∆wzm derivado de la cepa virulenta B. melitensis 16M previamente desarrollado en el grupo de Sanidad Animal del Instituto de Agrobiotecnología (IdAB). Como resultado, los mutantes carentes de O-PS externo exhibieron cambios de expresión génica, propiedades antigénicas del O-PS interno y cambios fenotípicos asociados a modificaciones de la membrana externa y/o de la pared celular. Además, los mutantes Rev1 ∆wzm/∆wzt fueron muy susceptibles tanto a polimixinas como a los antibióticos utilizados para el tratamiento de la brucelosis humana, en particular, a la estreptomicina; y mostraron una gran atenuación en ratón. Entre ellos, Rev1∆wzm destacó por inducir un pico de esplenomegalia transitoria, ser altamente inmunogénico y generar una protección eficaz frente a la infección virulenta por B. melitensis y por B. ovis en el modelo murino. En el capítulo 2, antes de estudiar la seguridad de Rev1∆wzm en su hospedador natural, se determinó la capacidad de este candidato vacunal para crecer en los medios de cultivo selectivos Farrell (FM) y CITA (CM), actualmente recomendados para el aislamiento primario de Brucella. La fuerte susceptibilidad del mutante a las polimixinas y la sinergia observada entre colistina y vancomicina conllevaron una severa inhibición de este candidato vacunal en ambos medios selectivos. Para resolverlo, se reformuló y evaluó el denominado Brucella Selective Medium (BSM) que, tras su evaluación con más de 1.700 muestras ovinas de campo, demostró ser capaz de mejorar el rendimiento de los medios anteriores. Además, profundizando en la productividad de BSM para otras brucellae, se observó que tanto BSM como CM inhibían el crecimiento de una colección de cepas B. abortus bv1. El análisis de las posibles causas llevó al desarrollo un segundo medio selectivo denominado Brucella Selective Improved Culture (BruSIC) que resultó permisivo para todas las cepas de Brucella analizadas y tan inhibidor como CM para las bacterias contaminantes habituales en muestras veterinarias. BruSIC ofrece la ventaja adicional de no precisar suero bovino para el aislamiento de cepas de Brucella suero-dependientes, lo que simplifica la preparación del medio, abarata costes y evita el uso de compuestos de origen animal. En el capítulo 3, se analizó la seguridad y respuesta inmune inducidas en corderos inoculados con Rev1∆wzm, demostrando que se activa la formación de anticuerpos sin interferir en las pruebas serológicas estándar para el diagnóstico de la brucelosis. Estos resultados, más otros logrados por el grupo de investigación en ganado adulto y en ovejas gestantes, hacen de este mutante un prometedor candidato vacunal para el control de la infección por B. melitensis y B. ovis en pequeños rumiantes. El contenido de estos tres capítulos de tesis ha sido publicado en las revistas científicas Frontiers in Microbiology (grupo Frontiers) y Microbiology Spectrum (ASM).
Open Access
Estudios de patogénesis placentaria por Brucella y caracterización molecular de Brucella suis bv2
(2022) Poveda Urkixo, Irati; Grilló Dolset, María Jesús; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua
La brucelosis es una zoonosis mundialmente extendida con importantes repercusiones económicas y sanitarias tanto para la ganadería como para el ser humano. Existen doce especies distintas de Brucella con distinta preferencia de hospedador; entre ellas, B. melitensis (bovino), B. abortus (pequeños rumiantes) y B. suis (porcino) son las más frecuentes en el ganado doméstico, y a excepción de B. suis bv2, suponen un grave riesgo para el ser humano. La vacunación de los animales es una herramienta esencial para reducir la infección en los mismos y, así, evitar la transmisión al ser humano. La infección en pequeños rumiantes es ocasionada por las especies Brucella melitensis y B. ovis; la primera de ellas produce abortos a final de gestación en hembras gestantes y la segunda, orquitis y epididimitis en machos con la consecuente reducción de la fertilidad. La cepa atenuada B. melitensisRev1 es la única vacuna recomendada desde hace más de 60 años contra la brucelosis en pequeños rumiantes. Pese a su extendido empleo y demostrada eficacia, Rev1 posee ciertos inconvenientes que recomiendan la búsqueda de una vacuna alternativa más segura que, idealmente, pueda aplicarse en animales gestantes. En este contexto, en el grupo de Brucelosis del IdAB-CSIC, se han desarrollado dos candidatos de Brucella melitensis mediante deleción en fase del gen wzm (16MΔwzmy Rev1Δwzm) involucrado en el sistema de dos componentes Wzm/Wztr es responsable de la exportación del polisacárido O al periplasma bacteriano para completar la biosíntesis del LPS liso. En los Capítulos 1 y 2 de esta Tesis Doctoral, se ha estudiado la seguridad, respuesta inmune y patogénesis placentaria de ambos candidatos vacunales, tanto en modelos preclínicos (i.e. cultivos de células trofoblásticas y ratona gestante) como en ganado ovino de distintos sexos y en distintos tercios de la gestación. Además, se han realizado estudios novedosos de patogénesis placentaria y respuesta inmune a lo largo de la gestación en ratonas inoculadas con distintas cepas de referencia de Brucella como son B. melitensis16M (virulenta) y Rev1 (atenuada) y B. ovis PA. Los principales resultados del Capítulo 1 indicaron que, en comparación con sus parentales, ambos mutantes rugosos poseían menor capacidad de invasión, replicación y efecto citotóxico en trofoblastos BeWo, menor capacidad de colonización placentaria en ratones con resolución de la infección a este nivel en los últimos estadíos de la gestación, ausencia de lesiones placentarias y elevada viabilidad fetal, así como menor respuesta proinflamatoria a lo largo de la gestación murina. En el Capítulo 2, ambos mutantes mostraron atenuación y buena respuesta serológica en carneros, ovejas no gestantes y ovejas gestantes inoculadas por las vías subcutánea o conjuntival, en distintos tercios de gestación. Aunque ninguno de los candidatos indujo abortos, Rev1∆wzmse consideró más seguro que 16M∆wzmpara ovejas gestantes, puesto que este último mostró una reactivación de la infección en el momento del parto, que conllevó la excreción transitoria por placenta/fluido vaginal y/o leche en algunos animales. En conjunto, los Capítulos 1 y 2 nos han permitido establecer una relación entre la multiplicación de Brucella en trofoblastos BeWo y placentas murinas, y su capacidad para inducir abortos y transmitirse a la descendencia en ovejas inoculadas a mitad de gestación. Asimismo, pese a la gran utilidad del modelo de ratona gestante para seleccionar candidatos más seguros, la evaluación final de ciertos parámetros de seguridad debe realizarse en el hospedador natural. Futuros ensayos de eficacia y respuesta inmune en ovino permitirán determinar la utilidad real de Rev1∆wzm, como alternativa a la actual vacuna Rev1.Trascomprobar las buenas propiedades vacunales de Rev1∆wzm, en el Capítulo 3 de esta Tesis se propuso construir un mutante en B. suis bv2 para abordar la lucha contra la brucelosis porcina, mediante la construcción y caracterización de Bs2Δwzm. Este mutante mostró propiedades bioquímicas distintas a 16M∆wzmo Rev1∆wzm, así como menor atenuación de la esperada. Durante estos estudios, detectamos que la cepa parental Bs2 presentaba una marcada inestabilidad de fase L→R no reportada anteriormente. Además, aplicando el modelo de ratona gestante puesto a punto en el Capítulo 1, estudiamos la patogénesis placentaria y respuesta inmune de Bs2 a lo largo de la gestación en ratonas. Por lo tanto, este Capítulo 3 se completó con un detallado análisis genético y fenotípico de la cepa Bs2, con el objetivo de determinar el alcance de dicha inestabilidad de fase tanto in vitro como in vivo, y las bases moleculares responsables de la misma. Los principales resultados indicaron que, en ausencia de escisiones o mutaciones en las regiones genéticas wboy wbk portadoras de genes implicados en la biosíntesis del LPS, este fenómeno podría deberse a variaciones en la expresión bacteriana, en función de las condiciones ambientales. De hecho, los cultivos con un elevado grado de disociación bacteriana mostraron una reducción significativa de la expresión de los genes codificantes de distintas manosil-y glicosil-transferasas, junto con un aumento de la expresión de la proteína de membrana externa Omp2b. Debido a su complejidad, en esta Tesis no ha sido posible determinar con exactitud los mecanismos moleculares implicados en la disociación espontánea de B. suisbv2, por lo que son necesarios más estudios que permitan comprender estos mecanismos, su implicación biológica, y con ello, construir una cepa B. suisbv2 estable sobre la que poder obtener candidatos vacunales adecuados frente a la brucelosis porcina. Uno de los resultados más interesantes de esta Tesis Doctoral ha sido evidenciar, por primera vez, que la disociación de Bs2 observada in vitro tiene una implicación in vivo, encontrando en un mismo animal bacterias con fenotipos lisos en tejidos placentarios y rugosos en tejidos esplénicos de ratones. Futuros estudios en cerdas gestantes permitirán dilucidar si este fenómeno de adaptación bacteriana ocurre también en el hospedador natural.
Open Access
Evaluación del interés del uso de una cubierta vegetal bajo la línea como estrategia de gestión del suelo en viñedos cultivados en condiciones de clima mediterráneo
(2022) Abad Zamora, Francisco Javier; Santesteban García, Gonzaga; Orcaray Echeverría, Luis; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
El manejo del suelo de los viñedos en condiciones de clima mediterráneo siempre ha primado reducir la competencia que pudieran generar otras plantas por los recursos nutricionales y, en especial, por los recursos hídricos. Sin embargo, los cambios de sistemas de producción, con desplazamiento de los viñedos a terrenos más fértiles, muchas veces dotadas de riego; la necesidad de buscar alternativas a los herbicidas como elementos de control de la vegetación adventicia, en especial en la zona ubicada bajo las cepas; plantean la posibilidad, o incluso la necesidad, de trabajar el suelo de manera diferente. En los últimos años, se ha avanzado de manera relevante en el estudio de las implicaciones del introducir las cubiertas vegetales como alternativa al uso de herbicidas y al laboreo, habiendo quedado de manifiesto el interés agronómico y ambiental de este cambio de manejo, que, como cualquier otro, debe acometerse considerando todas sus implicaciones en función de las particularidades de cada viñedo y objetivo agronómico-empresarial. Sin embargo, la práctica totalidad de las actuaciones encaminadas a introducir el uso de cubiertas en viñedos de zonas mediterráneas implican un cambio de gestión del suelo las calles, pero no del suelo bajo la línea de cultivo. En este contexto, la posibilidad de emplear una cubierta vegetal bajo la línea de cultivo que permitiera competir con otras adventicias pero no lo hiciera de manera relevante con el viñedo podría ser una alternativa de mucho interés. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado el comportamiento de una cubierta de T. fragiferum (UV) frente a un manejo con laboreo intercepas (T). Dicho ensayo se realizó durante tres campañas consecutivas (2018, 2019 y 2020) en un viñedo de Merlot ubicado en terrenos de Bodegas Ochoa en Traibuenas (Navarra-España), sobre un suelo Typic Calcixerepts y con un clima húmedo-templado mediterráneo según la clasificación de Papadakis. El conjunto de los resultados obtenidos permite concluir que el empleo de una cubierta de T. fragiferum bajo la línea de cultivo del viñedo en condiciones de clima mediterráneo constituye una alternativa realista al uso de herbicidas o laboreos intercepas. En las condiciones de ensayo, su uso ha redundado en una mejoría notable de los parámetros de calidad del suelo, sin apenas alterar el comportamiento agronómico y enológico de las cepas, resultando económicamente viable cuando se consigue una supervivencia de la cubierta mínima de tres años.
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Genetic diversity in Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus and factors involved in its generation
(2021) Aguirre Sánchez, Eduardo; Caballero Murillo, Primitivo; Beperet Arive, Inés; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
En la presente tesis se ha examinado la variabilidad genética de varios aislados de campo del nucleopoliedrovirus de Chrysodeixis includens (ChinNPV). Los resultados obtenidos revelan la gran variabilidad presente en los aislados naturales de ChinNPV, confirma las diferencias existentes entre dos variantes genotípicas procedentes de esos aislados y, lo más importante, parecen identificar a la variante ChinNPV-K como generadora de variabilidad en esos aislados. En conclusión, hemos encontrado una gran variabilidad en aislados naturales de ChinNPV, con una sola variante que muestra un papel clave en la generación de esta diversidad de manera dependiente de la concentración.
Embargo
Host-virus and virus-virus interactions in broad host range alphabaculoviruses: implications for the development of virus-based insecticides
(2021) Belda García, Isabel María; Caballero Murillo, Primitivo; Beperet Arive, Inés; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
Esta tesis se ha centrado en el estudio del potencial insecticida del nucleopoliedrovirus múltiple de Mamestra brassicae (MbMNPV), un virus de amplio espectro, y su interacción con el nucleopoliedrovirus múltiple de Helicoverpa armigera (HearMNPV) durante la coinfección en un huésped común. Los resultados obtenidos aportan un mejor entendimiento de las interacciones que se establecen entre diferentes virus y entre virus y huéspedes en alphabaculovirus de amplio espectro, lo cual podría ayudar a definir estrategias eficaces para el control de plagas de interés agronómico. En primer lugar, se evaluó la actividad insecticida y la estabilidad de dos aislados silvestres de alphabaculovirus altamente relacionados filogenéticamente, el HearMNPV y el MbMNPV derivado del bioinsecticida Mamestrin®, en un huésped permisivo (Spodoptera exigua) y uno semipermisivo (Spodoptera littoralis). Tras ello, se estudió la estructura genética del MbMNPV derivado del insecticida biológico Mamestrin® con el objetivo de evaluar las propiedades insecticidas de las variantes genotípicas que componen este aislado. Por último, se analizaron las interacciones que ocurren entre dos virus filogenéticamente cercanos cuando coinfectan a un huésped permisivo. En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis contribuyen a un mejor entendimiento de las interacciones que se establecen entre virus y huéspedes, lo cual puede ayudar al desarrollo de insecticidas basados en baculovirus y diseñar estrategias eficaces para el control de complejos de plagas de lepidópteros.
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Identificación de lentivirus de pequeños rumiantes en granulomas post-vacunales y evaluación de métodos de diagnóstico y selección genética en la lucha frente a la infección
(2021) Echeverría Garín, Irache; Reina Arias, Ramsés; Andrés Cara, Damián de; Glaría Ezquer, Idoia; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua
Esta tesis plantea tres objetivos que se desarrollarán en tres capítulos independientes, correspondientes a sus respectivas publicaciones. Por un lado, se ha caracterizado la presencia y replicación de SRLV en macrófagos procedentes de granulomas inducidos tras la vacunación con formulaciones basadas en hidróxido de aluminio, el adyuvante más común en las vacunas ovinas. En segundo lugar, se ha analizado una población de más de 1000 individuos en diferentes sistemas de producción y razas e infectados por diferentes cepas de SRLV. Se ha realizado un estudio serológico y molecular con las herramientas disponibles en el comercio y se ha analizado la asociación de parámetros productivos, en granjas de carne y leche, con la presencia de infección. Por último, se han analizado poblaciones ovinas correspondientes a cuatro razas de importancia productiva teniendo en cuenta su estado sanitario y el genotipo de la proteína TMEM154, uno de los candidatos más prometedores para su implantación en programas de selección genética.
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Identification and quantification of crystal components of Bacillus thuringiensis strains and their contribution to insecticidal activity
(2019) Caballero Sánchez, Javier; Caballero Murillo, Primitivo; Ancín Azpilicueta, Carmen; Jiménez Moreno, Nerea; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Ciencias; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Zientziak
El principal objetivo de esta tesis ha sido desarrollar un método proteómico que permite analizar cualitativa y cuantitativamente las proteínas que componen el cristal producido por distintas cepas silvestres de Bt. El método emplea un sistema de cromatografía líquida acoplada a un espectro de masas (LC-MS/MS) en combinación con una monitorización de múltiples reacciones (MRM). Para llevar a cabo el análisis, es necesario conocer la secuencia del genoma de la cepa Bt para determinar los potenciales genes insecticidas que podrían formar parte del cristal parasporal. El uso de herramientas bioinformáticas permite la selección de péptidos proteotípicos que detectan de forma específica la presencia de cada una de las proteínas de la mezcla. Estos péptidos proteotípicos, marcados isotópicamente, permiten determinar la proporción relativa de cada proteína en el cristal. El método fue validado utilizando dos mezclas artificiales de tres proteínas recombinantes (Cry1Aa, Cry2Aa y Cry6Aa), donde la proporción relativa de cada proteína era conocida. La aplicación del método permitió detectar las tres proteínas de forma independiente y cuantificar la proporción relativa de cada una de ellas con gran fiabilidad y precisión. Una vez verificada su validez, el método fue aplicado para determinar la composición del cristal de cuatro cepas Bt silvestres que component el ingrediente activo de los productos comerciales más vendidos a nivel mundial para el control de distintos órdenes de insecto: DiPel® y XenTari® para lepidópteros, VectoBac® para dípteros, y Novodor® para coleópteros. El cristal parasporal de la cepa ser. kurstaki ABTS-351 (DiPel®) resultó estar compuesto por cuatro proteínas: Cry1Aa (13-22%), Cry1Ab (16-29%), Cry1Ac (6-12%) y Cry2Aa (40-64%); al igual que la cepa ser. aizawai ABTS-1857 (XenTari®) Cry1Aa (26-33%), Cry1Ab (57-60%), Cry1Ca (7-11%) y Cry1Da (3-4%). La cepa AM65-52 (VectoBac®) sintetizó un cristal formado por Cry4Aa (2-4%), Cry4Ba (10-28%), Cry11Aa (10-27%), Cry60Aa (2-4%), Cry60Ba (5-12%) y Cyt1Aa (38-61%) y el ingrediente activo de Novodor®, la cepa ser. tenebrionis NB-176, contenía Cry3Aa (70-75%), Cry23Aa (14-16%) y Cry37Aa (10-14%). Adicionalmente, se determinó la actividad de la cepa ABTS-1857 en larvas de tres especies del género Spodoptera: S. exigua, S. littoralis y S. frugiperda. S. exigua fue la especie más susceptible (CL50= 7.8 ng/μl), seguida de S. littoralis (CL50= 28 ng/μl). S. frugiperda se mostró como la especie más tolerante (CL50= 120.2 ng/μl). Para determinar la contribución de cada proteína individual a la toxicidad general de la cepa ABTS-1857 contra cada una de las tres especies de insectos, se construyeron cepas Bt recombinantes que producían individualmente las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ca y Cry1Da. Los resultados de los bioensayos, utilizando el “droplet feeding method”, revelarón una elevada toxicidad de Cry1Ca para las larvas de S. exigua y S. littoralis y de Cry1Da frente a S. littoralis y S. frugiperda. Las mezclas artificiales de dos o tres proteínas produjeron mortalidades atribuibles a la cantidad de Cry1Ca, en el caso de S. exigua, de Cry1Ca y Cry1Da, en el caso de S. littoralis, y de Cry1Da en el caso de S. frugiperda. La mezcla artificial de cuatro proteínas, que reflejaba la composición natural del cristal, dio valores de actividad concordantes con los producidos por el cristal natural de la cepa ABTS-1857. Aumentos de la proteína Cry1Da, en detrimento de las proteías Cry1Aa y Cry1Ab, produjo incrementos en la actividad insecticida para larvas de S. littoralis y S. frugiperda. Estos resultados indicaron que la metodología empleada para el análisis de los cristales es válida para su empleo en la caracterización y estandarización de los productos comerciales basados en Bt, aportando la información necesaria para expresar su potencia insecticida.
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Implicación del metabolismo bacteriano en la interacción de Haemophilus influenzae con el sistema respiratorio humano: bases moleculares y explotación terapéutica
(2022) López López, Nahikari; Garmendia García, Juncal; Díez Martínez, Roberto; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua, referencia 0011-1408-2017-000000
Este trabajo de Tesis Doctoral aborda el papel de tres aspectos del metabolismo bacteriano (síntesis de purinas, catabolismo de glucosa, síntesis de ácidos grasos) en la interacción entre el patógeno Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano. Mediante análisis de expresión génica global, inactivación génica y caracterización fenotípica in vitro e in vivo, modelado computacional, química médica, y evaluación antimicrobiana a nivel preclínico, estudiamos los perfiles transcripcionales de patógeno y hospedador durante la infección respiratoria (Capítulo 2), la contribución del catabolismo de glucosa en la patogénesis de H. influenzae (Capítulo 3), y el potencial antimicrobiano de la inhibición de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos de esta bacteria (Capítulo 4). H. influenzae fue el primer organismo de vida libre cuyo genoma completo fue secuenciado, haciéndolo pionero en el desarrollo y empleo de técnicas -ómicas. El Capítulo 1 de este trabajo ha revisado la contribución de abordajes -ómicos incluyendo genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica, al estudio de la interacción entre HiNT y el sistema respiratorio humano. En el Capítulo 2 de este trabajo realizamos un estudio multi-ómico in vivo, consistente en la utilización de RNA-seq dual y Tn-seq durante el proceso de infección respiratoria murina por HiNT. El perfil de expresión génica diferencial entre bacterias cultivadas in vitro y bacterias recuperadas de lavado broncoalveolar murino mostró la sobre-expresión de genes que codifican enzimas implicadas en la síntesis de purinas y aminoácidos, así como de genes que codifican parte de la maquinaria de competencia natural de la bacteria. El aumento de los niveles de glucosa en las vías respiratorias de pacientes que sufren enfermedades respiratorias crónicas facilita la proliferación de patógenos que metabolizan este azúcar. HiNT cataboliza glucosa mediante una fermentación asistida por respiración que conlleva la excreción de acetato, formato y succinato. En el Capítulo 3 de este trabajo, diseñamos, generamos y caracterizamos un panel de cepas mutantes que no producen acetato, formato o succinato mediante la inactivación de los genes ackA, pflA y frdA, respectivamente. La inactivación de ackA limitó la producción de acetato y el crecimiento bacteriano, y estimuló tanto la producción de lactato en anaerobiosis como la atenuación bacteriana in vivo. El acetato excretado estimuló la expresión de genes pro-inflamatorios en células de epitelio respiratorio en cultivo, lo que sugiere que el catabolismo de glucosa contribuye no sólo al crecimiento de HiNT sino también a la inmunomodulación del sistema respiratorio humano. La resistencia de H. influenzae a antibióticos β-lactámicos ha llevado a su inclusión en la lista de patógenos bacterianos para los que la OMS considera prioritaria la búsqueda y desarrollo de nuevos antimicrobianos. En el Capítulo 4 de este trabajo, desarrollamos y validamos un modelo metabólico de H. influenzae a escala genómica, que utilizamos como herramienta de escrutinio in silico de genes esenciales de este patógeno, para su explotación como dianas terapéuticas. Este modelo predijo la esencialidad de un gran número de genes implicados en la síntesis de lípidos. Nos centramos en la enzima FabH, que cataliza la condensación descarboxilativa de malonil-ACP y acil-CoA en la iniciación de la biosíntesis de ácidos grasos. Nuestro modelado computacional mostró la idoneidad de la interacción de la molécula ácido 1- (5- (2-fluoro-5- (hidroximetil) fenil) piridin-2-il) piperidin- 4-acético y la proteína FabH. Este inhibidor redujo la viabilidad bacteriana de forma dosisdependiente. El efecto inhibitorio observado fue variable entre aislados clínicos portadores de distintas variantes alélicas del gen fabH, e independiente de su expresión. El inhibidor empleado no generó sinergias, no favoreció el desarrollo de resistencias, y no alteró la dinámica de infección epitelial por HiNT, mostrado además un efecto protector frente a la infección por HiNT in vivo. En conjunto, este trabajo de Tesis Doctoral proporciona conocimiento nuevo sobre el papel del metabolismo bacteriano en la interacción HiNT-sistema respiratorio humano, que esperamos sea de utilidad en el desarrollo de estrategias anti-infectivas que mejoren el manejo clínico de las enfermedades infecciosas asociadas a este patógeno.
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Innate immunity against small ruminant lentiviruses (SRLV): characterization of APOBEC3-derived restriction
(2020) Pablo Maiso, Lorena de; Reina Arias, Ramsés; Andrés Cara, Damián de; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua
En esta tesis se han llevado a cabo los siguientes estudios: 1. Identificación y caracterización de la restricción por APOBEC3 ovino frente a los SRLV. Se han estudiado dos tipos celulares que muestran restricción natural frente a los SRLV, monocitos y macrófagos-M1, identificando la isoforma Z1 como la más expresada, entre las proteínas APOBEC3 ovinas. En la caracterización genética de A3Z1 se ha identificado una isoforma adicional resultante de splicing alternativo, también presente en el transcriptoma humano y que carece del dominio citidín desaminasa (A3Z1Tr) característico de este tipo de proteínas. La expresión de estas proteínas se induce tanto tras la incubación con IFN-ɣ como con la infección viral. Ambas son resistentes a la degradación por Vif de SRLV y pueden encapsidarse en los viriones. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha podido determinar que ambas proteínas pueden interactuar entre sí así como con Vif viral, a pesar de la resistencia que presentan a su degradación. La expresión endógena de A3Z1 en células en cultivo tipo fibroblasto (T-immortalized goat epitelial fibroblasts, TIGEF) tan solo ha sido posible empleando estrategias de expresión transitoria, ya que los intentos de expresión permanente resultaban en cultivos abortivos. Las células TIGEF que expresan A3Z1 muestran una menor producción de SRLV. Ensayos de infectividad de un solo ciclo (single cycle infection) con vectores virales basados en HIV-1, MLV y SIV indican que A3Z1 ovino es capaz de inhibir la infectividad de dichos vectores. El mecanismo de restricción parece implicar la actividad citidín desaminasa en el contexto GA/AA. En ambos casos, la co-expresión de la isoforma truncada mitiga la restricción, probablemente por competición estérica con la proteína nativa en el interior de los viriones. 2. Caracterización de las vías de degradación de APOBEC3. Se ha investigado la capacidad de A3Z1 de restringir la infección con estirpes de SRLV que codifican la proteína Vif. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha podido comprobar que CYPA y no CBF-β es el cofactor necesario para la degradación de las proteínas APOBEC3 ovinas, requisito esencial en el caso de A3Z1 y A3Z1Tr. Concentraciones altas de CYPA permiten la degradación de A3Z1 por parte de Vif en diferentes tipos celulares, promoviendo así la infección por lentivirus. Sin embargo, no se alcanzan los niveles basales de A3Z1 empleando inhibidores del proteasoma y la degradación se produce también en presencia de Vif mutado, incapaz de reclutar el complejo ubiquitín ligasa y degradar así proteínas por la vía proteasomal, abriendo la posibilidad a la existencia de vías alternativas que permitan degradar A3Z1. Tan solo la combinación de inhibidores del proteasoma junto con inhibidores de la autofagia conseguían restablecer los niveles basales de A3Z1 sugiriendo la implicación de ambas vías. Además, la inhibición de la autofagia parece perjudicar la infección por SRLV, sugiriendo que la inducción podría favorecerla. 3. Estimulación de la respuesta innata ovina a través de la infección con vectores virales basados en el virus murino Sendai. La infección de células ovinas con un vector viral basado en el virus Sendai que codifica la proteína verde fluorescente (SeV-GFP) ha resultado ser del 100%, incluso en macrófagos de distintos orígenes. Sin embargo, la infección con SeV-GFP no se transmite en células ovinas y el vector es no replicativo. La infección con SeV-GFP ha activado una programación diferente dependiendo del tipo celular ovino, siendo la inducción de A3Z1 en células mieloides de especial importancia. La infección con SRLV y la producción de virus se encontraba disminuida en estas células tras el tratamiento con el vector viral. Los sobrenadantes procedentes de estos cultivos eran capaces de transmitir la restricción a células frescas, probablemente debido a la producción de interferón de tipo 1, sugiriendo que podría ser de utilidad en futuras estrategias de inmunización. La restricción también se ha observado frente a vectores basados en lentivirus, como HIV o SIV.
Embargo
Investigación de glucosinolatos presentes en crucíferas (Brassica) y su potencial aplicación industrial en la obtención de nuevos biocidas
(2024) Eugui Arrizabalaga, Daniel; Poveda Arias, Jorge; Caballero Berasategui, Sara; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
El presente trabajo se basa en la obtención de extractos bioactivos de brócoli (Brassica oleracea var. italica) con capacidad de inhibición de patógenos en campo, a partir de residuos de cultivo. Además, ya que el proyecto se enmarca en un entorno de colaboración universidad-empresa, se han valorado también la escalabilidad y la reproducibilidad industrial del proceso, estudiando la influencia de diversos factores de la extracción de GSLs que pudieran ser difícilmente adaptados a escala industrial. Este trabajo confirma la viabilidad de la estrategia de aprovechamiento de residuos de brócoli para la obtención de extractos bioactivos en la protección de cultivos frente a diversos patógenos de suelo y aéreos, desde la industrialización del proceso hasta su eficacia en condiciones cercanas a las reales.
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Mecanismos de regulación de la respuesta de las plantas a compuestos volátiles de origen microbiano
(2023) Gámez Arcas, Samuel; Muñoz Pérez, Francisco José; Pozueta Romero, Javier; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Las plantas son metaorganismos que regulan su desarrollo y metabolismo en respuesta a diferentes estímulos externos. Conviven con microorganismos emisores de compuestos que difunden a través del suelo tales como azúcares, proteínas, exopolisacáridos, sideróforos, ácidos grasos, ácidos orgánicos, aminoácidos y hormonas que modifican la fotosíntesis, el metabolismo y el crecimiento de las plantas (Philippot et al., 2013; De-la-Peña and Loyola-Vargas, 2014; Backer et al., 2018). Los microorganismos beneficiosos también emiten compuestos volátiles (VCs) que fomentan el crecimiento, la captación de nutrientes y la fotosíntesis, modulan la arquitectura de la raíz, activan la respuesta de defensa de la planta e incrementan su resistencia al estrés salino y la sequía (Ryu et al., 2003; Zhang et al., 2008; Splivallo et al., 2009; Zhang et al., 2009; Gutiérrez-Luna et al., 2010; Kanchiswamy et al., 2015; Park et al., 2015; Ledger et al., 2016). Estudios llevados a cabo por el grupo de investigación en el que he realizado mi tesis doctoral demostraron que las bacterias y los hongos fitopatógenos también emiten VCs con propiedades bioestimulantes (Sánchez-López et al., 2016b). Cambios en el crecimiento, la fotosíntesis, el desarrollo y el metabolismo de la planta inducidos por VCs microbianos están asociados a grandes variaciones en el transcriptoma, el proteoma y el redox-proteoma de la planta (Sánchez- López et al., 2016b; Ameztoy et al., 2019, 2021). Tales variaciones sugieren que la respuesta de la planta a los VCs microbianos está regulada tanto a nivel transcripcional como no-transcripcional. Con el fin de profundizar en los mecanismos que median la relación entre la planta y los microorganismos, en este trabajo investigué el papel que juega el transportador de hexosas fosfato plastidial (GPT2) inducible por VCs en la respuesta de la planta modelo de laboratorio Arabidopsis thaliana a VCs emitidos por el hongo fitopatógeno Altenaria alternata. Además, investigué el papel que juega en dicha respuesta el residuo de cisteína 95 de la fructosa bifosfatasa plastidial (cFBP1), un enzima del ciclo de Calvin-Benson cuya actividad está sujeta a cambios en el estado redox inducibles por la luz. En el capítulo 1 de esta tesis presento los resultados de mi investigación sobre el papel que juega GPT2 en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. Para realizar esta investigación, analicé y comparé el crecimiento, la fotosíntesis y el proteoma de plantas wild type (WT), mutantes carentes GPT2 (gpt2-1), mutantes carentes PGI1 (pgi1-2) y doble mutante pgi1-2gpt2-1 cultivadas en presencia o ausencia de VCs fúngicos. Además, caractericé la respuesta a estos compuestos de plantas pgi1-2/gpt2-1 que expresan GPT2 bajo el control de un promotor específico de haces vasculares. Finalmente, caractericé el patrón de expresión de GPT2 en plantas que expresan el gen reportero GUS bajo la acción de la secuencia promotora de GPT2. Los resultados obtenidos mostraron que, de manera similar a lo que ocurre en plantas WT, los VCs fomentan el crecimiento, la fotosíntesis y la acumulación de citoquininas activas y almidón en plantas pgi1-2 y gpt2-1. Tal respuesta fue reducida en plantas pgi1-2gpt2-1 y se revirtió a WT al expresar GPT2 en haces vasculares. Estudios comparativos de los proteomas de plantas pgi1-2 y pgi1-2gpt2-1 mostraron que GPT2 regula la expresión de proteínas relacionadas con la fotosíntesis. Es más, los estudios de expresión mostraron que GPT2 se expresa en haces vasculares y está sujeto a complejos mecanismos de regulación. Globalmente, los resultados presentados en este capítulo indican que en condiciones en las cuales la actividad de PGI está reducida, la respuesta de la planta a VCs microbianos conlleva una regulación de la expresión de proteínas relacionadas con la fotosíntesis a través de mecanismos en los que GPT2 juega un papel importante en la provisión de sustrato necesario para la producción de citoquininas en haces vasculares. Trabajos llevados a cabo en el grupo de investigación en el que he realizado este mi tesis mostraron que la exposición a VCs microbianos conlleva cambios globales en el redox-proteoma de las plantas (Ameztoy et al., 2019). Tales cambios incluían la reducción de residuos de cisteína altamente conservados a lo largo de la evolución de enzimas del ciclo de Calvin-Benson. En el capítulo 2 presento los resultados de mi investigación sobre el papel que juega el residuo de cisteína 95 de la cFBP1 en su actividad, en la fotosíntesis y en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. Para realizar esta investigación, comparé las propiedades electroforéticas y cinéticas de cFBP1 WT y una forma mutada en la que el residuo de cisteína 95 fue sustituido por un residuo de serina (C95S). Además, comparé la fotosíntesis y el crecimiento de plantas de Arabidopsis cfbp1 carentes de cFBP1 endógena que expresan ectópicamente formas WT o C95S de cFBP1. Los resultados mostraron que el residuo de cisteína 95 juega un papel importante en la actividad de cFBP1 y en la fotosíntesis, pero no en el crecimiento de Arabidopsis.
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Mecanismos moleculares de adaptación del patógeno respiratorio Haemophilus influenzae y desarrollo de nuevos antimicrobianos
(2020) Fernández Calvet, Ariadna; Garmendia García, Juncal; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua
La tesis doctoral aborda tres aspectos de la interacción entre el patógeno oportunista colonizador Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano, considerando la regulación patoadaptativa por variación de fase (Capítulo 1), la importancia del mantenimiento de la integridad superficial bacteriana (Capítulo 2), y el potencial terapéutico de moléculas xenohorméticas (Capítulo 3). En conjunto, este trabajo amplía nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares de patoadaptación respiratoria de HiNT, proporciona evidencias sobre el papel de VacJ/MlaA en la modulación de la supervivencia bacteriana en las vías respiratorias, y señala el potencial terapéutico de moléculas xenohorméticas.
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Multifunctional analysis of new Bacillus thuringiensis strains and their potential as pest control agents
(2023) Unzue Pozas, Argiñe; Caballero Murillo, Primitivo; Caballero Sánchez, Carlos; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
El uso de plaguicidas químicos ha sido la práctica más extendida para el control de plagas en agricultura en los últimos 80 años. Sin embargo, estos tipos de insecticidas han experimentado fuertes medidas regulatorias que limitan su uso debido a su falta de bioseguridad. Por lo tanto, nunca ha sido mayor la necesidad de alternativas seguras, sostenibles y respetuosos con el medio ambiente. Bioinsecticidas, y más específicamente, soluciones basadas en Bacillus thuringiensis (Bt) han conseguido popularidad en los programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP) debido a sus propiedades biocidas, adaptabilidad, y sobre todo seguridad. Bt es una bacteria Gram-positiva que forma espora de Resistencia durante la fase estacionaria de crecimiento y un cristal parasporal compuesto de d-endotoxinas (entre otras, proteínas Cry y Cyt) con actividad insecticida. Bt es el agente entomopatógeno más empleado comúnmente para control de plagas en campo y su uso es compatible con otros métodos de control. El principal propósito de esta tesis era el estudio de diversidad de cepas y el potencial pesticida de cepas de Bt de tres colecciones. Cada colección comprendía cepas aisladas de un hábitat específico, siendo granjas avícolas localizadas en el sur de los Pirineos, dehesas de Extremadura y áreas no cultivadas de diversas regiones del mundo. Se aislaron un total de 294 cepas y agrupadas en 44 grupos o perfiles basados en su contenido de genes plaguicidas. Los tres hábitats mostraron una diversidad de genes plaguicidas moderado y no se encontró una correlación directa entre genes específicos y hábitat. Sin embargo, algunos genes fueron más frecuentes en ciertos ambientes. Por ejemplo, a pesar de que los genes cry1, cry2, y cry9 estaban presentes en los tres hábitats, cry1 y cry2 eran relativamente más abundantes en áreas no cultivadas. El potencial de propiedades pesticidas de los 44 diferentes perfiles fueron caracterizados in silico basado en la bibliografía disponible y se encontró que los perfiles más frecuentes pertenecían a cepas con el potencial de controlar especies de lepidópteros (conteniendo genes cry1, cry2 y cry9) para todos los hábitats estudiados. Estos fueron seguidos por potenciales cepas nematicidas (con genes parecidos a cry5 y app6), que fueron también identificados en todos los hábitats estudiados. Cepas con hipotética actividad contra coleópteros (genes cry3 y genes cry8 y similares) y dípteros (cry4, cry10, cry11 y cyt) fueron encontrados solamente en granjas y dehesas. La caracterización in silico fue posteriormente verificada in vivo, probando a una única concentración (10 µg/ml) de esporas y cristales de cada perfil contra especies representativas de órdenes de insectos de lepidópteros (Spodoptera littoralis y Helicoverpa armigera), dípteros (Aedes albopictus) y coleópteros (Leptinotarsa decemlineata). De modo interesante, algunos de los perfiles de lepidópteros activos identificados en este estudio contenían combinaciones de genes diferentes (cry1C, cry1D, cry1E, cry2A, xpp22-similar) a la mayoría de las cepas encontradas como productos comerciales ampliamente utilizados (DiPel® y Xentari®). Ensayos realizados contra mosquitos y coleópteros también aportaron resultados prometedores de grupos que contenían genes plaguicidas diferentes a los más comúnmente utilizados por soluciones de Bt (p. ej. Vectobac® y Novodor®, respectivamente). Hoy en día, la mayoría de los productos del mercado basados en Bt están destinados al control de plagas de lepidópteros, coleópteros y dípteros. Sin embargo, otras plagas de gran importancia en agricultura quedan a menudo fuera del alcance de dichas soluciones. Algunos ejemplos de esto son ácaros, nematodos y hongos. Uno de los objetivos de esta tesis fue abordar las propiedades multifuncionales de una cepa de Bt (de las colecciones construidas) con el potencial de controlar varias plagas, incluidas aquellas para las que las soluciones de Bt actuales no ofrecen cobertura. Teniendo esto en cuenta, se seleccionó la cepa candidata BST-122, que presentaba un interesante contenido génico plaguicida. Para evaluar el potencial multifuncional de BST-122, se realizaron bioensayos contra el escarabajo de la patata (L. decemlineata), para el cual las esporas y cristales produjeron una mortalidad significativa. Además, una proteína similar a Cry5 producida por la cepa resultó tóxica contra el complejo ácaro fitófago Tetranychus urticae cuando se administró en altas concentraciones. Cuando se evaluó contra los nematodos fitoparásitos Meloidogyne incognita en ensayos en planta, los factores secretados de la cepa produjeron una reducción significante de las agallas en las raíces de las plantas de pepino. Finalmente, BST-122 produjo una considerable deceleración del crecimiento en dos serovares diferentes de Fusarium oxysporum (lycopersici y meloni) y Verticillium dahliae en condiciones in vitro. En definitiva, esta tesis proporciona información sobre la diversidad de cepas silvestres de Bt que pertenecen a diferentes hábitats y su potencial para controlar diferentes organismos plaga. Además, se muestran las propiedades multifuncionales de una cepa Bt, enfatizando la importancia de nuevas proteínas y factores secretados para expandir el uso de soluciones de Bt más allá de los confinamientos de los órdenes de insectos de lepidópteros, coleópteros y dípteros e incluir otros organismos plaga de importancia económica.
Embargo
New functions for Cyt proteins and sporulation determinants in Bacillus thuringiensis
(2023) Lai, Liliana; Caballero Murillo, Primitivo; Caballero Sánchez, Carlos; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
En este estudio, primero nos centramos a encontrar nuevas proteínas insecticidas y factores sinérgicos con actividad contra larvas de A. albopictus. Nuestro primer objetivo, fue caracterizar la actividad individual de las proteínas del cristal Cyt1Aa, Cry4Aa, Cry4Ba y Cry11Aa contra A. albopictus y encontrar nuevas proteínas que contribuyesen a diversificar los ingredientes activos basados en Bt actualmente disponibles. Uno de nuestros resultados nos permitió encontrar y caracterizar una nueva proteína Cyt1A-like, que aumentaba la actividad de Cry11Aa más de 10 veces y activaba a tres proteínas nuevas Cry53-like, Cry56Alike y Tpp36-like que no eran tóxicas por sí solas. Estos resultados posicionaron a las proteínas Cyt como facilitadores de la actividad de proteínas cristalinas que, de otro modo, no resultaban tóxicas. Como segundo objetivo, nos centramos en comprender el vínculo entre la esporulación y la formación de cristales en Bt. En la literatura, se describe extensamente cómo se acoplan ambos procesos están estrechamente relacionados. Sin embargo, la mayoría de dichos estudios suelen girar en torno a reguladores generales de la esporulación que, además, son críticos para la expresión de proteínas cristalinas. En este caso, nuestro objetivo fue encontrar determinantes de esporulación que fueran críticos para la generación de las esporas, pero prescindibles para la formación de los cristales. A través de una estrategia de mutagénesis aleatoria, descubrimos un gen esencial para la esporulación, spoIIIAA, que no afectaba a la producción del cristal. El transcriptoma del mutante spoIIIAA reveló que varios genes de la esporulación, así como una hidrolasa de la pared celular se encontraban afectados en su expresión. Además, varios factores de virulencia se encontraron sobre expresados, sin embargo, los genes de la proteína cristalina mantuvieron sus niveles de expresión sin cambios. Finalmente, reproducimos la misma mutación, mediante mutagénesis dirigida, en la cepa AM 65-52. Tanto la cepa parental como el mutante asporígeno derivado conservaron la capacidad de producir cristales activos contra las larvas de Aedes aegypti y A. albopictus. En resumen, en este trabajo proporcionamos nuevos conocimientos sobre las proteínas del cristal con actividad frente a mosquitos, especialmente las proteínas Cyt y su capacidad para habilitar la actividad de proteínas que, de otro modo, no serían tóxicas. Análogamente, se presentan resultados que posicionan a SpoIIIAA como un regulador crítico de la esporulación que no afecta a la expresión de las proteínas cristalinas.
Open Access
Novel application of bioassays and functional importance of minor crystal components of Bacillus thuringiensis serovar israelensis for dipteran pests
(2020) Valtierra de Luis, Daniel; Caballero Murillo, Primitivo; Villanueva San Martín, Maite; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura
Bacillus thuringiensis (Berliner, 1915) (Bt) es una bacteria Gram-positiva de forma redondeada que tiene la capacidad de formar esporas de resistencia. Bajo condiciones desfavorables, la bacteria esporula produciendo la espora y el cristal paraesporal. Este cristal está compuesto principalmente por una o más proteínas insecticidas, también llamadas δ-endotoxinas, las cuales son capaces de formar inclusiones cristalinas. Los insecticidas basados en Bt representan alrededor del 80% de todos los bio-plaguicidas existentes en el mercado. La toxicidad específica de las proteínas del cristal contra insectos diana es la base para el empleo de Bt como bioplaguicida en agricultura, selvicultura y control de mosquitos desde 1961. Actualmente la alternativa más importante para el control de larvas de mosquito y mosca se basa en toxinas producidas por B. thuringiensis ser. israelensis (Bti). Son necesarios métodos de bioensayo simples y reproducibles para evaluar la toxicidad de nuevos compuestos insecticidas para el manejo de plagas y para determinar la presencia de resistencias en poblaciones plaga. Hemos utilizado un isótopo radioactivo basado en 32P-ATP para estimar el volumen ingerido por dos plagas de dípteros: Ceratitis capitata (Tephritidae) y Drosophila suzukii (Drosophilidae). Utilizando un colorante azul en el tratamiento, fue posible distinguir individuos que habían ingerido la solución de aquellos que no lo había hecho. El volumen medio ingerido por adultos de C. capitata fue 1.968 μl. Las hembras ingirieron aproximadamente un 20% más de volumen que los machos. Los adultos de D. suzukii ingirieron una media de 0.879 μl, ingiriendo las hembras aproximadamente un ⁓30% más que los machos. El método de la gota fue validado utilizando como ingrediente activo (i.a.) el plaguicida de origen natural spinosad. En C. capitata, la respuesta concentración-mortalidad no varió entre sexos, ni entre tres lotes distintos de insectos. Los valores de dosis letal fueron calculados basándonos en el volumen medio ingerido. En C. capitata los valores de LD50 fueron 1.462 and 1.502 ng i.a./insecto para machos y hembras respectivamente. Cuando se consideró la variación específica del peso corporal dependiente de sexo, obtuvimos valores de 0.274 and 0.271 ng i.a./mg para machos y hembras respectivamente. Empleamos el mismo método para determinar los valores de D. suzukii. Esta técnica puede ser directamente empleada para determinar los estados de resistencia y la respuesta dosis-mortalidad de un compuesto insecticida en muchas especies de dípteros plaga. Bacillus thuringiensis ser. israelensis (Bti) forma cuerpos de inclusión paraesporales con forma semiesférica compuestos de proteínas insecticidas, representadas principalmente por cinco familias (Cry4, Cry10, Cry11, Cyt1 and Cyt2), los cuales son ampliamente utilizados como larvicidas microbianos frente a plagas de dípteros. La actividad insecticida del cristal completo es alta si se compara con las actividades de las proteínas individuales, probablemente debido a las interacciones sinérgicas que existen entre las distintas proteínas del cristal, especialmente aquellas que involucran a Cyt1Aa. En este estudio se clonaron Cry10Aa y Cyt2Ba a partir del producto comercial con actividad larvicida VectoBac® 12AS y se expresaron en la cepa de Bt acristalófora BMB171. Estas proteínas mostraron valores de LC50 de 299.62 y 279.37 ng/ml, respectivamente, frente a larvas de segundo estadio de A. aegypti, pero no mostraron actividad tóxica frente a adultos de C. capitata. Cuando las larvas de A. aegypti ingirieron una mezcla equitativa (ratio 1:1) de esporas y cristales de las proteínas recombinantes Cry10Aa y Cyt2Ba, se observó una fuerte actividad sinérgica. Se estimó que la magnitud de este efecto sinérgico fue de 34.3, encontrándose entre los valores más altos descritos hasta el momento para los componentes del cristal de Bti, y comparable a los publicados previamente para Cyt1A con Cry4A y Cry11A. Por lo tanto, los componentes minoritarios de Bti tienen una relevancia en la toxicidad global de la cepa y ambas proteínas pueden desempeñar un papel importante en la sinergia y en la prevención de la aparición de resistencias.