Person: Caballero Sánchez, Javier
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Caballero Sánchez
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Javier
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Producción Agraria
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Publication Open Access Domain shuffling between Vip3Aa and Vip3Ca: chimera stability and insecticidal activity against European, American, African, and Asian pests(MDPI, 2020) Gomis Cebolla, Joaquín; Santos, Rafael Ferreira dos; Wang, Yueqin; Caballero Sánchez, Javier; Caballero Murillo, Primitivo; He, Kanglai; Jurat Fuentes, Juan Luis; Ferré, Juan; Institute for Multidisciplinary Research in Applied Biology - IMABThe bacterium Bacillus thuringiensis produces insecticidal Vip3 proteins during the vegetative growth phase with activity against several lepidopteran pests. To date, three different Vip3 protein families have been identified based on sequence identity: Vip3A, Vip3B, and Vip3C. In this study, we report the construction of chimeras by exchanging domains between Vip3Aa and Vip3Ca, two proteins with marked specificity differences against lepidopteran pests. We found that some domain combinations made proteins insoluble or prone to degradation by trypsin as most abundant insect gut protease. The soluble and trypsin-stable chimeras, along with the parental proteins Vip3Aa and Vip3Ca, were tested against lepidopteran pests from different continents: Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa armigera, Mamestra brassicae, Anticarsia gemmatalis, and Ostrinia furnacalis. The exchange of the Nt domain (188 N-terminal amino acids) had little effect on the stability and toxicity (equal or slightly lower) of the resulting chimeric protein against all insects except for S. frugiperda, for which the chimera with the Nt domain from Vip3Aa and the rest of the protein from Vip3Ca showed a significant increase in toxicity compared to the parental Vip3Ca. Chimeras with the C-terminal domain from Vip3Aa (from amino acid 510 of Vip3Aa to the Ct) with the central domain of Vip3Ca (amino acids 189–509 based on the Vip3Aa sequence) made proteins that could not be solubilized. Finally, the chimera including the Ct domain of Vip3Ca and the Nt and central domain from Vip3Aa was unstable. Importantly, an insect species tolerant to Vip3Aa but susceptible to Vip3Ca, such as Ostrinia furnacalis, was also susceptible to chimeras maintaining the Ct domain from Vip3Ca, in agreement with the hypothesis that the Ct region of the protein is the one conferring specificity to Vip3 proteins.Publication Open Access Identification and quantification of crystal components of Bacillus thuringiensis strains and their contribution to insecticidal activity(2019) Caballero Sánchez, Javier; Caballero Murillo, Primitivo; Ancín Azpilicueta, Carmen; Jiménez Moreno, Nerea; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Ciencias; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; ZientziakEl principal objetivo de esta tesis ha sido desarrollar un método proteómico que permite analizar cualitativa y cuantitativamente las proteínas que componen el cristal producido por distintas cepas silvestres de Bt. El método emplea un sistema de cromatografía líquida acoplada a un espectro de masas (LC-MS/MS) en combinación con una monitorización de múltiples reacciones (MRM). Para llevar a cabo el análisis, es necesario conocer la secuencia del genoma de la cepa Bt para determinar los potenciales genes insecticidas que podrían formar parte del cristal parasporal. El uso de herramientas bioinformáticas permite la selección de péptidos proteotípicos que detectan de forma específica la presencia de cada una de las proteínas de la mezcla. Estos péptidos proteotípicos, marcados isotópicamente, permiten determinar la proporción relativa de cada proteína en el cristal. El método fue validado utilizando dos mezclas artificiales de tres proteínas recombinantes (Cry1Aa, Cry2Aa y Cry6Aa), donde la proporción relativa de cada proteína era conocida. La aplicación del método permitió detectar las tres proteínas de forma independiente y cuantificar la proporción relativa de cada una de ellas con gran fiabilidad y precisión. Una vez verificada su validez, el método fue aplicado para determinar la composición del cristal de cuatro cepas Bt silvestres que component el ingrediente activo de los productos comerciales más vendidos a nivel mundial para el control de distintos órdenes de insecto: DiPel® y XenTari® para lepidópteros, VectoBac® para dípteros, y Novodor® para coleópteros. El cristal parasporal de la cepa ser. kurstaki ABTS-351 (DiPel®) resultó estar compuesto por cuatro proteínas: Cry1Aa (13-22%), Cry1Ab (16-29%), Cry1Ac (6-12%) y Cry2Aa (40-64%); al igual que la cepa ser. aizawai ABTS-1857 (XenTari®) Cry1Aa (26-33%), Cry1Ab (57-60%), Cry1Ca (7-11%) y Cry1Da (3-4%). La cepa AM65-52 (VectoBac®) sintetizó un cristal formado por Cry4Aa (2-4%), Cry4Ba (10-28%), Cry11Aa (10-27%), Cry60Aa (2-4%), Cry60Ba (5-12%) y Cyt1Aa (38-61%) y el ingrediente activo de Novodor®, la cepa ser. tenebrionis NB-176, contenía Cry3Aa (70-75%), Cry23Aa (14-16%) y Cry37Aa (10-14%). Adicionalmente, se determinó la actividad de la cepa ABTS-1857 en larvas de tres especies del género Spodoptera: S. exigua, S. littoralis y S. frugiperda. S. exigua fue la especie más susceptible (CL50= 7.8 ng/μl), seguida de S. littoralis (CL50= 28 ng/μl). S. frugiperda se mostró como la especie más tolerante (CL50= 120.2 ng/μl). Para determinar la contribución de cada proteína individual a la toxicidad general de la cepa ABTS-1857 contra cada una de las tres especies de insectos, se construyeron cepas Bt recombinantes que producían individualmente las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ca y Cry1Da. Los resultados de los bioensayos, utilizando el “droplet feeding method”, revelarón una elevada toxicidad de Cry1Ca para las larvas de S. exigua y S. littoralis y de Cry1Da frente a S. littoralis y S. frugiperda. Las mezclas artificiales de dos o tres proteínas produjeron mortalidades atribuibles a la cantidad de Cry1Ca, en el caso de S. exigua, de Cry1Ca y Cry1Da, en el caso de S. littoralis, y de Cry1Da en el caso de S. frugiperda. La mezcla artificial de cuatro proteínas, que reflejaba la composición natural del cristal, dio valores de actividad concordantes con los producidos por el cristal natural de la cepa ABTS-1857. Aumentos de la proteína Cry1Da, en detrimento de las proteías Cry1Aa y Cry1Ab, produjo incrementos en la actividad insecticida para larvas de S. littoralis y S. frugiperda. Estos resultados indicaron que la metodología empleada para el análisis de los cristales es válida para su empleo en la caracterización y estandarización de los productos comerciales basados en Bt, aportando la información necesaria para expresar su potencia insecticida.Publication Open Access Identificación y producción de proteínas de Bacillus thuringiensis: evaluación de su actividad insecticída(2014) Caballero Sánchez, Javier; Palma Dovis, Leopoldo; Matas Casado, Isabel María; Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos; Nekazaritza Ingeniarien Goi Mailako Eskola TeknikoaLa bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis (Bt) es el microorganismo más empleado actualmente como materia activa en el desarrollo de bioinsecticidas y la construcción de plantas transgénicas (planta Bt) resistentes a los insectos. Todo ello se debe a su gran capacidad para producir una enorme variedad de proteínas con elevada toxicidad contra un amplio número de especies de insectos que suelen originar importantes plagas agrícolasGforestales o de interés médicoGveterinario. En este trabajo se ha analizado el genoma de la cepa L60 de B. thuringiensis serovar ibérica (BtibGL60) con el objetivo de identificar genes que codifiquen para nuevas proteínas con potencial actividad insecticida por si mismas o una posible acción sinérgica para otras proteínas insecticidas ya descritas. El resultado más relevante ha sido la identificación de 5 nuevos genes que codifican para proteínas con similitudes del 99 %, 56 %, 44 % y 51 % a las proteínas Bel_Enhancin, Cry32Ba1, Cry66Aa2 y Vip4Aa1, previamente descritas y, en virtud de lo cual, se prevé que puedan tener actividad insecticida. Todos estos genes, excepto uno (el homólogo a vip4Aa1), se han logrado expresar, pero sólo en uno de estos casos (el homólogo a cry32Ba1) se ha conseguido obtener la proteína en fase soluble. La proteína soluble Cry32Ba1, así como las proteínas solubles que componen el cristal BtibGL60 y las que se encuentran en el sobrenadante de la fermentación de esta cepa, han sido caracterizadas mediante bioensayos para determinar su actividad insecticida. Los bioensayos cualitativos realizados contra 7 especies del orden Lepidoptera (Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Mamestra brassicae, Chrysodeixis chalcites, Helicoverpa armigera, Ostrinia nubilalis y Lobesia botrana), una especie de Coleoptera (Leptinotarsa decemlineata) y una especie de Diptera (Ceratitis capitata) han revelado que ninguna de estas especies de insectos son susceptibles a ninguna de las proteínas evaluadas, excepto la moderada susceptibilidad mostrada por C. chalcites a la proteína Cry32Ba1 y por C. capitata a las proteínas del cristal de BtibGL60. Se discute el interés práctico y el alcance del estudio realizado dentro del campo de los bioinsecticidas microbianos