Open Access
Biología de plásmidos y dinámica génica en el complejo Pseudomonas syringae
(2017) Añorga García, Maite; Murillo Martínez, Jesús; Bardají Goikoetxea, Leire; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
La mayoría de las cepas de Pseudomonas syringae posee uno o más plásmidos nativos tipo PFP, que suelen albergar genes adaptativos y que facilitan el intercambio de los mismos entre poblaciones bacterianas. P. syringae pv. savastanoi NCPPB 3335 causa la tuberculosis del olivo (Olea europaea) y es un patógeno modelo para el estudio de la patogénesis bacteriana en plantas leñosas. Esta cepa contiene tres plásmidos PFP estables que han sido completamente secuenciados —pPsv48A, 80 kb; pPsv48B, 45 kb, y pPsv48C, 42 kb— y que portan varios posibles genes de virulencia. A pesar de la importancia de los plásmidos PFP en el ciclo de vida de P. syringae, todavía se desconocen muchos aspectos de su genética y biología, por lo que en esta Tesis nos hemos propuesto los siguientes objetivos: 1) identificación y caracterización funcional de un segundo origen de replicación presente en el plásmido nativo pPsv48C de Ps pv. savastanoi NCPPB 3335; 2) identificación de determinantes de mantenimiento presentes en los plásmidos de la cepa NCPPB 3335 y evaluación de su contribución al mantenimiento de dichos plásmidos, y 3) evaluación del papel del plásmido pPsv48C en la patogenicidad y virulencia de la cepa NCPPB 3335 en su interacción con su planta huésped, olivo. Hemos identificado un segundo replicón en pPsv48C, que es una quimera por compartir su región de control y promotor con el replicón no homólogo RepA-PFP. Hemos demostrado que este tipo de quimeras es frecuente en al menos cuatro familias de replicasas no homólogas de Pseudomonas, incluyendo bacterias patógenas de plantas, animales y humanos. Estos replicones constan de dos módulos funcionales e independientes correspondientes a las regiones de control (módulo REx-C), que actúa como determinante de incompatibilidad, y de replicación (módulo REx-R). Mediante ensayos funcionales, hemos determinado que los tres plásmidos de NCPPB 3335 utilizan diversas estrategias y mecanismos para aumentar su estabilidad. Así, la presencia de estos dos replicones, y especialmente del replicón RepJ, confiere una alta estabilidad a pPsv48C. Además, hemos documentado que los elementos repetitivos IS801 y MITEPsy2 generan frecuentes deleciones y reorganizaciones plasmídicas, cuya frecuencia se reduce por un factor entre 3 y 50 debido a la acción de tres sistemas toxina-antitoxina codificados en pPsv48A y otros tres codificados en pPsv48C. Asimismo, estos sistemas reducen en dos órdenes de magnitud la frecuencia de pérdida espontánea del plásmido pPsv48A y contribuyen al mantenimiento de los genes de virulencia ptz (en pPsv48A) e idi (en pPsv48C). Mediante inactivación funcional de los sistemas de mantenimiento de pPsv48C, hemos obtenido un derivado de NCPPB 3335 curado de sus tres plásmidos nativos (cepa UPN912), que no produce tumores en olivo. Mediante inoculaciones con esta cepa y con mutantes específicos hemos demostrado que el gen idi —que codifica una posible isopentenil difosfato isomersa y éstá probablemente implicado en la biosíntesis de citoquininas— es esencial para la producción de tumores de tamaño silvestre tanto en plantas micropropagadas como en olivos lignificados. En conjunto, nuestros resultados indican que la cepa NCPPB 3335 contiene tres plásmidos nativos de virulencia, que están expuestos a frecuentes eventos de reorganización genética cuyo efecto se ve contrarrestado por la existencia de múltiples determinantes plasmídicos de estabilidad, que a la vez contribuyen a disminuir la pérdida espontánea de los plásmidos y al mantenimiento de genes de virulencia durante el ciclo de vida de la bacteria.
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Evaluación del efecto de las condiciones ambientales en la transposición de elementos móviles en la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae
(2011) Añorga García, Maite; Murillo Martínez, Jesús; Bardají Goikoetxea, Leire; Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos; Nekazaritza Ingeniarien Goi Mailako Eskola Teknikoa; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Los elementos genéticos móviles están muy extendidos en Pseudomonas syringae , y a menudo están asociados con genes de virulencia. Se han identificado diecisiete tipos de secuencias de inserción y dos “miniature inverted repeat transposable elements” (elementos transponibles miniatura con repeticiones invertidas) MITEs, en P. syringae pv. phaseolicola (Pph) 1448A. Para evaluar si alguno de estos elementos genéticos móviles se activa dentro del genoma, hemos empleado un vector trampa que contiene el gen sacB , que permite la selección de inserciones que inactiven sacB en medios con sacarosa. La frecuencia de transposición en Pph 1448A osciló entre 2,6 × 10 H5 y 1,1 × 10 H6 , dependiendo del clon, aunque se mantuvo estable para cada clon después de varias transferencias consecutivas en medios de cultivo. La frecuencia de transposición fue similar en bacterias cultivadas en medio rico y mínimo, así como en células recuperadas de plantas hospedadoras compatibles e incompatibles. Igualmente no se observaron variaciones en la frecuencia de transposición en las cepas 1448A y 1302A de P. syringae pv. phaseolicola y P. syringae pv. syringae B728a en respuesta a un choque térmico. Estos resultados sugieren que las condiciones de crecimiento y las condiciones de estrés no influyen en la frecuencia de transposición de elementos móviles en cepas de P. syringae . Un 65% de las inserciones atrapadas en sacB en P. syringae pv. phaseolicola 1448A contenían una copia completa de IS 801 , mientras que las inserciones restantes correspondían a las secuencias más pequeñas que cualquiera de los elementos transponibles identificados en la cepa 1448A, y colectivamente identificados como secuencias en miniatura. La mayoría de las secuencias miniatura fueron fragmentos de 229 (8,3%), 360 (0,5%) y 679 nt (16,9%) de la parte derecha de IS 801 . Estos tres tipos de fragmentos se originan en el extremo 3’ de IS 801 y terminan en un tetranucleótido con similitud al extremo 5’ del elemento, por lo que probablemente son el resultado de una transposición terminal (one-ended transposition) de IS 801 . Un promedio de 0,7% de las inserciones analizadas contenían una copia completa de IS 801 unida a un fragmento de tamaño variable de los genes PSPPH_0008/PSPPH_0017, demostrando que este elemento puede movilizar ADN adyacente in vivo . Igualmente, hemos demostrado la movilidad de una secuencia de 100 nt que previamente se ha encontrado insertada en genes de virulencia alterando la especificidad de huésped. Esta secuencia miniatura, designada MITE Psy1 representa un promedio del 2,4% del total de inserciones, y es el primer MITE cuya movilidad se ha demostrado in vivo en bacterias.

Añorga García, Maite

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