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Fernández Escalada, Manuel

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https://academica-e.unavarra.es/handle/2454/49012

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Fernández Escalada

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Manuel

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Ciencias del Medio Natural

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An aerated axenic hydroponic system for the application of root treatments: exogenous pyruvate as a practical case
(BioMed Central, 2018) Gil Monreal, Miriam; Fernández Escalada, Manuel; Royuela Hernando, Mercedes; Zabalza Aznárez, Ana; Ciencias; Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Background: Hydroponic systems are a convenient platform for plant cultivation when treatments are applied to the roots because they provide precise control of the composition of the growth medium, ensuring the availability of different compounds. A problem arises when axenic conditions are needed but the treatment of choice (exogenous organic acids or sugars) promote the growth of unwanted microorganisms. Moreover, axenic conditions are usually applied in liquid and semi-liquid growing systems, where oxygen availability can be compromised, if no aeration is provided. Results: The driver for the development of this hydroponic system was the application of the organic acid pyruvate to the roots of plants grown under aerated axenic conditions. No contamination was detected in the nutrient solution, even after the addition of pyruvate. The system was validated in pea plants treated with either pyruvate or herbicides inhibiting amino acid biosynthesis. The effects on ethanol fermentation were compared by analysing the enzymatic activity, protein content and transcriptional levels in plants treated with either pyruvate or herbicides. Conclusions: The developed system enables the study of the exogenous application of organic acids in the nutrient solution under axenic conditions and without oxygen limitation. This system allows the study of the effect of any type of treatments applied to roots under aerated axenic hydroponic systems at physiological and molecular levels. The role of pyruvate in the induction of fermentation by herbicides cannot be simply explained by an increase in substrate availability.
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Effects of EPSPS Copy Number Variation (CNV) and glyphosate application on the aromatic and branched chain amino acid synthesis pathways in Amaranthus palmeri
(Frontiers Media, 2017) Fernández Escalada, Manuel; Zulet González, Ainhoa; Gil Monreal, Miriam; Zabalza Aznárez, Ana; Ravet, Karl; Gaines, Todd; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
A key enzyme of the shikimate pathway, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS; EC 2.5.1.19), is the known target of the widely used herbicide glyphosate. Glyphosate resistance in Amaranthus palmeri, one of the most troublesome weeds in agriculture, has evolved through increased EPSPS gene copy number. The aim of this work was to study the pleiotropic effects of (i) EPSPS increased transcript abundance due to gene copy number variation (CNV) and of (ii) glyphosate application on the aromatic amino acid (AAA) and branched chain amino acid (BCAA) synthesis pathways. Hydroponically grown glyphosate sensitive (GS) and glyphosate resistant (GR) plants were treated with glyphosate 3 days after treatment. In absence of glyphosate treatment, high EPSPS gene copy number had only a subtle effect on transcriptional regulation of AAA and BCAA pathway genes. In contrast, glyphosate treatment provoked a general accumulation of the transcripts corresponding to genes of the AAA pathway leading to synthesis of chorismate in both GS and GR. After chorismate, anthranilate synthase transcript abundance was higher while chorismate mutase transcription showed a small decrease in GR and remained stable in GS, suggesting a regulatory branch point in the pathway that favors synthesis toward tryptophan over phenylalanine and tyrosine after glyphosate treatment. This was confirmed by studying enzyme activities in vitro and amino acid analysis. Importantly, this upregulation was glyphosate dose dependent and was observed similarly in both GS and GR populations. Glyphosate treatment also had a slight effect on the expression of BCAA genes but no general effect on the pathway could be observed. Taken together, our observations suggest that the high CNV of EPSPS in A. palmeri GR populations has no major pleiotropic effect on the expression of AAA biosynthetic genes, even in response to glyphosate treatment. This finding supports the idea that the fitness cost associated with EPSPS CNV in A. palmeri may be limited.
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Characterization of the Amaranthus palmeri physiological response to glyphosate in susceptible and resistant populations
(ACS Publications, 2016) Fernández Escalada, Manuel; Gil Monreal, Miriam; Zabalza Aznárez, Ana; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
The herbicide glyphosate inhibits the plant enzyme 5-enolpyruvylshikimate3-phosphate synthase (EPSPS) in the aromatic amino acid (AAA) biosynthetic pathway. The physiologies of an Amaranthus palmeri population exhibiting resistance to glyphosate by EPSPS gene amplification (NC-R) and a susceptible population (NC-S) were compared. The EPSPS copy number of NC-R plants was 47.5-fold the copy number of NC-S plants. Although the amounts of EPSPS protein and activity were higher in NC-R plants than in NC-S plants, the AAA concentrations were similar. The increases in total free amino acid and in AAA contents induced by glyphosate were more evident in NC-S plants. In both populations, the EPSPS protein increased after glyphosate exposure, suggesting regulation of gene expression. EPSPS activity seems tightly controlled in vivo. Carbohydrate accumulation and a slight induction of ethanol fermentation were detected in both populations.
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Physiological action of herbicides inhibiting amino acid biosynthesis and their sustainable mixtures in Amaranthus palmeri sensitive and resistant to glyphosate
(2018) Fernández Escalada, Manuel; Zabalza Aznárez, Ana; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Durante el siglo pasado, la producción agrícola se ha ido incrementando en todo el mundo gracias a la mejora en sus técnicas de manejo. Una de las herramientas más poderosas para alcanzar ese incremento en la producción fueron los herbicidas, los cuales eliminan las malas hierbas que compiten con los cultivos por los recursos naturales. Sin embargo, el uso inapropiado de los herbicidas ha desencadenado la aparición de resistencias en malas hierbas, un problema global para la agricultura que se ha ido incrementando durante los últimos 30 años. El glifosato es el herbicida más usado en todo el mundo debido a su efectividad como herbicida total, y sobre todo desde la aparición de cultivos genéticamente modificados resistentes a este herbicida. La diana del glifosato es la enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), en la ruta biosintética de los aminoácidos aromáticos (AAA). Una de las peores malas hierbas que se ha descrito como resistente al glifosato es Amaranthus palmeri, cuyo mecanismo de resistencia es la amplificación génica de la enzima EPSPS, lo que conlleva una sobreexpresión de ésta enzima diana del glifosato. El objetivo general de este trabajo fue evaluar los efectos fisiológicos desencadenados por el glifosato que llevan a los individuos de las poblaciones sensible (GS) y resistente (GR) a la muerte, centrándolo fundamentalmente en las consecuencias del tratamiento con glifosato sobre la ruta de los AAA y la ruta de los aminoácidos ramificados (BCAA). Además, se aplicarion mezclas de glifosato y el inhibidor de la AHAS imazamox (inhibidor de la ruta de los BCAA) para profundizar en la regulación de ambas rutas biosintéticas de aminoácidos y su posible regulación cruzada, además de para confirmar o rechazar la posibilidad del empleo de las mezclas como una alternativa a la aplicación del glifosato en solitario. Para estas metas, la respuesta al glifosato de una población sensible (GS) y otra resistente (GR) de A. palmeri obtenidas en Carolina del Norte, fueron comparada a los niveles molecular y bioquímico. En este trabajo se ha confirmado la correlación entre la sobreexpresión génica, el contenido proteico y el nivel de actividad de la enzima EPSPS con el nivel de resistencia de la población GR de A. palmeri. Los altos niveles de variación en el número de copias génicas (CNV) de la enzima EPSPS no tuvieron efectos importantes en los parámetros estudiados: la expresión de las rutas de biosíntesis de los AAA y de los BCAA, el contenido en aminoácidos libres y el contenido en carbohidratos fue similar para ambas poblaciones en condiciones de control. Esto sugiere que la CNV de la enzima EPSPS no tuvo un efecto pleiotrópico importante en la fisiología de las plantas resistentes. La acumulación de siquimato producida tras el tratamiento con glifosato en la población GS (pero no en la GR) indicó que la afección producida en la población sensible fue mayor. Los incrementos en los niveles de aminoácidos totales libres y aromáticos, menores en la población GR que en la GS, confirmaron que el daño producido en la población sensible fue mayor. Se estudió la respuesta transcripcional de las poblaciones GS y GR al tratamiento con glifosato, y se detectó una inducción general de la expresión de las enzimas de la ruta de los AAA. Se encontraron incrementos muy grandes en los niveles de tránscritos de la enzima Antranilato sintasa mientras que los niveles de tránscritos de la enzima Corismato mutasa no se incrementaron, lo que sugiere un flujo preferencial de carbono hacia la formación de triptófano en vez de tirosina o fenilalanina tras el punto regulatorio de la formación de corismato en presencia del herbicida. La ausencia de respuesta al tratamiento con glifosato en la expresión génica de la ruta biosintética de los BCAA, y de la ruta de los AAA al imazamox, sugirió que no existe regulación cruzada entre las rutas biosintéticas de los AAA y de los BCAA a nivel transcripcional, a pesar de su estrecha relación. Por último, las interacciones entre las mezclas de dos dosis diferentes de glifosato y una de imazamox se estudiaron en A. palmeri. Se detectó un efecto antagonista general en los principales parámetros fisiológicos: siquimato, aminoácidos y niveles de carbohidratos, porque los efectos detectados con las mezclas fueron en su mayoría menores que la adición de los efectos individuales de cada herbicida. Este antagonismo fisiológico general sugiere que al aplicar la mezcla de glifosato e imazamox en campo, las dosis recomendadas no pueden ser disminuidas. Resumiendo, esta tesis describe nuevos aspectos fisiológicos en la caracterización de la población de Carolina del Norte resistente al glifosato y desentraña el modo de acción del glifosato en plantas sensibles y resistentes cuando éste es aplicado individualmente o combinado con imazamox.
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Efecto del glifosato y de diferentes intermediarios metabólicos en la regulación de la ruta del siquimato
(Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa, 2017) Zulet González, Ainhoa; Fernández Escalada, Manuel; Gil Monreal, Miriam; Zabalza Aznárez, Ana; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
En este estudio se han abordado los mecanismos de regulación de la ruta del siquimato en la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos. Para ello se han comparado el contenido de siquimato y de los enzimas EPSPS (5-enolpiruvilsiquimato- 3-fosfato sintasa) y DAHPS (3-Deoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa, enzima de entrada a la ruta) en hojas de dos poblaciones de Amaranthus palmeri (una sensible y otra resistente al glifosato) incubadas con glifosato y/o con diferentes intermediarios de la ruta (siquimato, quinato, fosfoenolpiruvato, y aminoácidos aromáticos). En ambas poblaciones se dieron similares efectos regulatorios de los intermediarios, evidenciando que la sobreexpresión de EPSPS no modifica de manera significativa la regulación general de la ruta. El enzima DAHPS se confirma como enzima clave en la regulación y en la respuesta al glifosato; su síntesis es inhibida por los productos finales de la ruta y por el quinato, y su regulación puede explicar la acumulación de siquimato tras la aplicación de glifosato.
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The pattern of shikimate pathway and phenylpropanoids after inhibition by glyphosate or quinate feeding in pea roots
(Elsevier, 2017) Zabalza Aznárez, Ana; Orcaray Echeverría, Luis; Fernández Escalada, Manuel; Zulet González, Ainhoa; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
The shikimate pathway is a metabolic route for the biosynthesis of aromatic amino acids (AAAs) (i.e. phenylalanine, tyrosine, and tryptophan). A key enzyme of shikimate pathway (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS) is the target of the widely used herbicide glyphosate. Quinate is a compound synthesized in plants through a side branch of the shikimate pathway. Glyphosate provokes quinate accumulation and exogenous quinate application to plants shows a potential role of quinate in the toxicity of the herbicide glyphosate. Based on this, we hypothesized that the role of quinate accumulation in the toxicity of the glyphosate would be mediated by a deregulation of the shikimate pathway. In this study the effect of the glyphosate and of the exogenous quinate was evaluated in roots of pea plants by analyzing the time course of a full metabolic map of several metabolites of shikimate and phenylpropanoid pathways. Glyphosate application induced an increase of the 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase (DAHPS, first enzyme of the shikimate pathway) protein and accumulation of metabolites upstream of the enzyme EPSPS. No common effects on the metabolites and regulation of shikimate pathway were detected between quinate and glyphosate treatments, supporting that the importance of quinate in the mode of action of glyphosate is not mediated by a common alteration of the regulation of the shikimate pathway. Contrary to glyphosate, the exogenous quinate supplied was probably incorporated into the main trunk from the branch pathway and accumulated in the final products, such as lignin, concomitant with a decrease in the amount of DAHPS protein.
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Physiological performance of glyphosate and imazamox mixtures on Amaranthus palmeri sensitive and resistant to glyphosate
(Nature Research, 2019) Fernández Escalada, Manuel; Zulet González, Ainhoa; Gil Monreal, Miriam; Royuela Hernando, Mercedes; Zabalza Aznárez, Ana; Institute for Multidisciplinary Research in Applied Biology - IMAB; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
The herbicides glyphosate and imazamox inhibit the biosynthetic pathway of aromatic amino acids (AAA) and branched-chain amino acids (BCAA), respectively. Both herbicides share several physiological effects in the processes triggered in plants after herbicide application that kills the plant, and mixtures of both herbicides are being used. The aim of this study was to evaluate the physiological effects in the mixture of glyphosate and imazamox in glyphosate-sensitive (GS) and -resistant (GR) populations of the troublesome weed Amaranthus palmeri. The changes detected in the physiological parameters after herbicide mixtures application were similar and even less to the changes detected after individual treatments. This pattern was detected in shikimate, amino acid and carbohydrate content, and it was independent of the EPSPS copy number, as it was detected in both populations. In the case of the transcriptional pattern of the AAA pathway after glyphosate, interesting and contrary interactions with imazamox treatment were detected for both populations; enhancement of the effect in the GS population and alleviation in the GR population. At the transcriptional level, no cross regulation between AAA and BCAA inhibitors was confirmed. This study suggests that mixtures are equally or less toxic than herbicides alone, and would implicate careful considerations when applying the herbicide mixtures.
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Efecto del glifosato en la expresión génica de la ruta del siquimato en Amaranthus palmeri
(Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa, 2017) Fernández Escalada, Manuel; Zulet González, Ainhoa; Gil Monreal, Miriam; Zabalza Aznárez, Ana; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Este estudio ha abordado el efecto del herbicida glifosato en la regulación de la ruta del siquimato en la especie Amaranthus palmeri, comparando una población sensible a glifosato con una población resistente. Se han determinado, mediante PCR cuantitativa (qPCR), el efecto de dos dosis de glifosato sobre la expresión génica de los enzimas de la ruta del siquimato. También se ha determinado la actividad enzimática de los enzimas post-corismato antranilato sintasa (AS) y corismato mutasa (CM). Se ha podido observar que el gran aumento en el número de copias génicas del enzima EPSPS en la población resistente no tiene un efecto pleiotrópico basal en la expresión de los demás genes de esta ruta de síntesis de los aminoácidos aromáticos. Tras el tratamiento con glifosato, se observó, en ambas poblaciones, una inducción general de la expresión de los genes de la ruta del siquimato, dependiente de la dosis de glifosato. Es destacable que la aplicación del glifosato provoca el aumento de la expresión y actividad AS, y la tendencia opuesta en expresión CM, lo que conlleva un flujo preferente hacia la formación de triptófano en lugar de tirosina y fenilalanina.
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Enhancement of glyphosate efficacy on Amaranthus palmeri by exogenous quinate application
(Elsevier, 2019) Zulet González, Ainhoa; Fernández Escalada, Manuel; Zabalza Aznárez, Ana; Royuela Hernando, Mercedes; Institute for Multidisciplinary Research in Applied Biology - IMAB; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Glyphosate is a widely used herbicide targeting the enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS) in the aromatic amino acid biosynthesis pathway (shikimate pathway) and provoking accumulation of quinate, a secondary metabolite synthesized through a side branch of this pathway. The objective of this work was to evaluate whether the efficacy of glyphosate activity in Amaranthus palmeri is enhanced by quinate application one day after herbicide treatment. To this end, one glyphosate-sensitive and one glyphosate-resistant (due to EPSPS gene amplification) population of A. palmeri were used. The 3- day time course study of the quinate treatment alone showed quinate, Tyr and Phe accumulation in both populations. When the herbicide was applied alone at 0.25× the recommended dose, no phytotoxicity or glyphosate effects were detected in the sensitive population 3 days after treatment, but the combined treatment with quinate was lethal, and markers of herbicide activity at the amino acid level could be detected. In the resistant population, an important metabolic perturbation in the flux of the shikimate pathway was detected in the combined treatment. These results raise the possibility of the joint application of quinate and glyphosate to enhance glyphosate efficacy while lowering doses in the sensitive population.
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Efecto de la especie forestal y de la gestión en la capacidad de intercepción de agua por el suelo
(2013) Fernández Escalada, Manuel; Ametzaga Arregi, Ibone; Peña López, Lorena; Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos; Nekazaritza Ingeniarien Goi Mailako Eskola Teknikoa
El presente estudio analiza de forma sencilla la importancia de la hojarasca y la materia orgánica del suelo en el ciclo hidrológico como agente que acumula agua, ya que sin su presencia pasaría directamente al suelo. El muestreo se llevó a cabo en un pinar de Pinus sylvestris con presencia en algunas zonas de Fagus sylvatica de Navarra (Aspurz), el cual había sido sometido 9 parcelas a diferentes tratamientos de clara (0%, 20% y 40%, tres replicas de cada una). En cada parcela se tomaron 16 muestras, 8 bajo dosel donde sólo había pino y 8 bajo dosel mixto. Cada muestra consistió en una muestra de hojarasca (25x25cm) y una muestra del horizonte orgánico del suelo (Horizonte O) (10x10cm). Posteriormente en el laboratorio todas las muestras se dejaron secar, se pesaron y se humedecieron durante 24h para medir el volumen máximo de agua que podían acumular. A continuación se pesaron y volvieron a secar. Los datos indicaron que el único factor que influyó tanto en la acumulación de hojarasca como del horizonte O del suelo fue el tipo de dosel arbóreo. La hojarasca mixta retuvo mayor cantidad de agua, y por tanto posee una mayor capacidad de acumular agua, al mismo tiempo que permite que haya una mayor acumulación del horizonte O del suelo. En el caso del grado de clareo, se observó un efecto sobre la capacidad de almacenamiento de agua del horizonte O del suelo, siendo mayor en el suelo que se encuentra bajo doseles no clareados pudiendo deberse a que no ha sido perturbado durante las labores de clareo. Además, se ha observado que aunque la capacidad de almacenar agua por la hojarasca es mayor que la del horizonte O del suelo, la mayor cantidad de éste último hace que tenga un papel más importante a la hora de la intercepción de agua. Así, se puede concluir que la capacidad del sistema de interceptar el agua transcolada fue suficiente en el periodo estudiado para que no fluyera agua por escorrentía salvo en momentos puntuales de precipitaciones especialmente intensas.