Fernández Escalada, Manuel

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https://academica-e.unavarra.es/handle/2454/49012

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Fernández Escalada

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Manuel

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Ciencias del Medio Natural

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Physiological action of herbicides inhibiting amino acid biosynthesis and their sustainable mixtures in Amaranthus palmeri sensitive and resistant to glyphosate
(2018) Fernández Escalada, Manuel; Zabalza Aznárez, Ana; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Durante el siglo pasado, la producción agrícola se ha ido incrementando en todo el mundo gracias a la mejora en sus técnicas de manejo. Una de las herramientas más poderosas para alcanzar ese incremento en la producción fueron los herbicidas, los cuales eliminan las malas hierbas que compiten con los cultivos por los recursos naturales. Sin embargo, el uso inapropiado de los herbicidas ha desencadenado la aparición de resistencias en malas hierbas, un problema global para la agricultura que se ha ido incrementando durante los últimos 30 años. El glifosato es el herbicida más usado en todo el mundo debido a su efectividad como herbicida total, y sobre todo desde la aparición de cultivos genéticamente modificados resistentes a este herbicida. La diana del glifosato es la enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), en la ruta biosintética de los aminoácidos aromáticos (AAA). Una de las peores malas hierbas que se ha descrito como resistente al glifosato es Amaranthus palmeri, cuyo mecanismo de resistencia es la amplificación génica de la enzima EPSPS, lo que conlleva una sobreexpresión de ésta enzima diana del glifosato. El objetivo general de este trabajo fue evaluar los efectos fisiológicos desencadenados por el glifosato que llevan a los individuos de las poblaciones sensible (GS) y resistente (GR) a la muerte, centrándolo fundamentalmente en las consecuencias del tratamiento con glifosato sobre la ruta de los AAA y la ruta de los aminoácidos ramificados (BCAA). Además, se aplicarion mezclas de glifosato y el inhibidor de la AHAS imazamox (inhibidor de la ruta de los BCAA) para profundizar en la regulación de ambas rutas biosintéticas de aminoácidos y su posible regulación cruzada, además de para confirmar o rechazar la posibilidad del empleo de las mezclas como una alternativa a la aplicación del glifosato en solitario. Para estas metas, la respuesta al glifosato de una población sensible (GS) y otra resistente (GR) de A. palmeri obtenidas en Carolina del Norte, fueron comparada a los niveles molecular y bioquímico. En este trabajo se ha confirmado la correlación entre la sobreexpresión génica, el contenido proteico y el nivel de actividad de la enzima EPSPS con el nivel de resistencia de la población GR de A. palmeri. Los altos niveles de variación en el número de copias génicas (CNV) de la enzima EPSPS no tuvieron efectos importantes en los parámetros estudiados: la expresión de las rutas de biosíntesis de los AAA y de los BCAA, el contenido en aminoácidos libres y el contenido en carbohidratos fue similar para ambas poblaciones en condiciones de control. Esto sugiere que la CNV de la enzima EPSPS no tuvo un efecto pleiotrópico importante en la fisiología de las plantas resistentes. La acumulación de siquimato producida tras el tratamiento con glifosato en la población GS (pero no en la GR) indicó que la afección producida en la población sensible fue mayor. Los incrementos en los niveles de aminoácidos totales libres y aromáticos, menores en la población GR que en la GS, confirmaron que el daño producido en la población sensible fue mayor. Se estudió la respuesta transcripcional de las poblaciones GS y GR al tratamiento con glifosato, y se detectó una inducción general de la expresión de las enzimas de la ruta de los AAA. Se encontraron incrementos muy grandes en los niveles de tránscritos de la enzima Antranilato sintasa mientras que los niveles de tránscritos de la enzima Corismato mutasa no se incrementaron, lo que sugiere un flujo preferencial de carbono hacia la formación de triptófano en vez de tirosina o fenilalanina tras el punto regulatorio de la formación de corismato en presencia del herbicida. La ausencia de respuesta al tratamiento con glifosato en la expresión génica de la ruta biosintética de los BCAA, y de la ruta de los AAA al imazamox, sugirió que no existe regulación cruzada entre las rutas biosintéticas de los AAA y de los BCAA a nivel transcripcional, a pesar de su estrecha relación. Por último, las interacciones entre las mezclas de dos dosis diferentes de glifosato y una de imazamox se estudiaron en A. palmeri. Se detectó un efecto antagonista general en los principales parámetros fisiológicos: siquimato, aminoácidos y niveles de carbohidratos, porque los efectos detectados con las mezclas fueron en su mayoría menores que la adición de los efectos individuales de cada herbicida. Este antagonismo fisiológico general sugiere que al aplicar la mezcla de glifosato e imazamox en campo, las dosis recomendadas no pueden ser disminuidas. Resumiendo, esta tesis describe nuevos aspectos fisiológicos en la caracterización de la población de Carolina del Norte resistente al glifosato y desentraña el modo de acción del glifosato en plantas sensibles y resistentes cuando éste es aplicado individualmente o combinado con imazamox.
Open Access
Effects of EPSPS Copy Number Variation (CNV) and glyphosate application on the aromatic and branched chain amino acid synthesis pathways in Amaranthus palmeri
(Frontiers Media, 2017) Fernández Escalada, Manuel; Zulet González, Ainhoa; Gil Monreal, Miriam; Zabalza Aznárez, Ana; Ravet, Karl; Gaines, Todd; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
A key enzyme of the shikimate pathway, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS; EC 2.5.1.19), is the known target of the widely used herbicide glyphosate. Glyphosate resistance in Amaranthus palmeri, one of the most troublesome weeds in agriculture, has evolved through increased EPSPS gene copy number. The aim of this work was to study the pleiotropic effects of (i) EPSPS increased transcript abundance due to gene copy number variation (CNV) and of (ii) glyphosate application on the aromatic amino acid (AAA) and branched chain amino acid (BCAA) synthesis pathways. Hydroponically grown glyphosate sensitive (GS) and glyphosate resistant (GR) plants were treated with glyphosate 3 days after treatment. In absence of glyphosate treatment, high EPSPS gene copy number had only a subtle effect on transcriptional regulation of AAA and BCAA pathway genes. In contrast, glyphosate treatment provoked a general accumulation of the transcripts corresponding to genes of the AAA pathway leading to synthesis of chorismate in both GS and GR. After chorismate, anthranilate synthase transcript abundance was higher while chorismate mutase transcription showed a small decrease in GR and remained stable in GS, suggesting a regulatory branch point in the pathway that favors synthesis toward tryptophan over phenylalanine and tyrosine after glyphosate treatment. This was confirmed by studying enzyme activities in vitro and amino acid analysis. Importantly, this upregulation was glyphosate dose dependent and was observed similarly in both GS and GR populations. Glyphosate treatment also had a slight effect on the expression of BCAA genes but no general effect on the pathway could be observed. Taken together, our observations suggest that the high CNV of EPSPS in A. palmeri GR populations has no major pleiotropic effect on the expression of AAA biosynthetic genes, even in response to glyphosate treatment. This finding supports the idea that the fitness cost associated with EPSPS CNV in A. palmeri may be limited.
Open Access
Physiological performance of glyphosate and imazamox mixtures on Amaranthus palmeri sensitive and resistant to glyphosate
(Nature Research, 2019) Fernández Escalada, Manuel; Zulet González, Ainhoa; Gil Monreal, Miriam; Royuela Hernando, Mercedes; Zabalza Aznárez, Ana; Institute for Multidisciplinary Research in Applied Biology - IMAB; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
The herbicides glyphosate and imazamox inhibit the biosynthetic pathway of aromatic amino acids (AAA) and branched-chain amino acids (BCAA), respectively. Both herbicides share several physiological effects in the processes triggered in plants after herbicide application that kills the plant, and mixtures of both herbicides are being used. The aim of this study was to evaluate the physiological effects in the mixture of glyphosate and imazamox in glyphosate-sensitive (GS) and -resistant (GR) populations of the troublesome weed Amaranthus palmeri. The changes detected in the physiological parameters after herbicide mixtures application were similar and even less to the changes detected after individual treatments. This pattern was detected in shikimate, amino acid and carbohydrate content, and it was independent of the EPSPS copy number, as it was detected in both populations. In the case of the transcriptional pattern of the AAA pathway after glyphosate, interesting and contrary interactions with imazamox treatment were detected for both populations; enhancement of the effect in the GS population and alleviation in the GR population. At the transcriptional level, no cross regulation between AAA and BCAA inhibitors was confirmed. This study suggests that mixtures are equally or less toxic than herbicides alone, and would implicate careful considerations when applying the herbicide mixtures.
Open Access
Efecto del glifosato en la expresión génica de la ruta del siquimato en Amaranthus palmeri
(Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa, 2017) Fernández Escalada, Manuel; Zulet González, Ainhoa; Gil Monreal, Miriam; Zabalza Aznárez, Ana; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Este estudio ha abordado el efecto del herbicida glifosato en la regulación de la ruta del siquimato en la especie Amaranthus palmeri, comparando una población sensible a glifosato con una población resistente. Se han determinado, mediante PCR cuantitativa (qPCR), el efecto de dos dosis de glifosato sobre la expresión génica de los enzimas de la ruta del siquimato. También se ha determinado la actividad enzimática de los enzimas post-corismato antranilato sintasa (AS) y corismato mutasa (CM). Se ha podido observar que el gran aumento en el número de copias génicas del enzima EPSPS en la población resistente no tiene un efecto pleiotrópico basal en la expresión de los demás genes de esta ruta de síntesis de los aminoácidos aromáticos. Tras el tratamiento con glifosato, se observó, en ambas poblaciones, una inducción general de la expresión de los genes de la ruta del siquimato, dependiente de la dosis de glifosato. Es destacable que la aplicación del glifosato provoca el aumento de la expresión y actividad AS, y la tendencia opuesta en expresión CM, lo que conlleva un flujo preferente hacia la formación de triptófano en lugar de tirosina y fenilalanina.
Open Access
Efecto del glifosato y de diferentes intermediarios metabólicos en la regulación de la ruta del siquimato
(Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa, 2017) Zulet González, Ainhoa; Fernández Escalada, Manuel; Gil Monreal, Miriam; Zabalza Aznárez, Ana; Royuela Hernando, Mercedes; Ciencias del Medio Natural; Natura Ingurunearen Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
En este estudio se han abordado los mecanismos de regulación de la ruta del siquimato en la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos. Para ello se han comparado el contenido de siquimato y de los enzimas EPSPS (5-enolpiruvilsiquimato- 3-fosfato sintasa) y DAHPS (3-Deoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa, enzima de entrada a la ruta) en hojas de dos poblaciones de Amaranthus palmeri (una sensible y otra resistente al glifosato) incubadas con glifosato y/o con diferentes intermediarios de la ruta (siquimato, quinato, fosfoenolpiruvato, y aminoácidos aromáticos). En ambas poblaciones se dieron similares efectos regulatorios de los intermediarios, evidenciando que la sobreexpresión de EPSPS no modifica de manera significativa la regulación general de la ruta. El enzima DAHPS se confirma como enzima clave en la regulación y en la respuesta al glifosato; su síntesis es inhibida por los productos finales de la ruta y por el quinato, y su regulación puede explicar la acumulación de siquimato tras la aplicación de glifosato.