Desarrollo de un método de conjugación y edición genética eficiente en cepas clínicas de Enterococos

El género de bacterias Enterococcus presenta una amenaza grave para la salud en los ambientes hospitalarios, siendo la segunda causa más frecuente de infecciones nosocomiales. En concreto, la especie Enterococcus faecalis, protagoniza el 80% de los casos. Este agente presenta una isla de patogenicidad (PAI) que porta numerosos factores de virulencia, entre los que destaca el gen esp, que codifica una proteína de superficie promotora de la formación de biofilm, lo cual facilita las mencionadas infecciones oportunistas. En este momento, el estudio mediante modificación genética de E. faecalis, sobre todo en cepas clínicas, resulta sumamente complejo por la escasez de herramientas de biología molecular funcionales y eficientes que lo permitan. Por este motivo, en este trabajo se ha desarrollado una herramienta molecular que permite la modificación genética en Enterococcus sin dejar marcadores de resistencia. Esta herramienta, denominada pMAD_Ent, está basada en un plásmido que se replica eficientemente en E. faecalis, que elimina una de las principales limitaciones presentes en otras herramientas disponibles. Además, el plásmido porta la secuencia del origen de transferencia (oriT) del sistema RP4, permitiendo transformar por conjugación cepas clínicas que son difícilmente electroporables, suponiendo un sistema rápido y eficiente, alternativo a la transformación por electroporación. Como prueba de concepto, se seleccionó el gen esp por su relevancia en la biología de este patógeno para construir mutantes por deleción utilizando esta nueva herramienta. En primer lugar, se realizó el análisis estructural de las diferentes regiones adyacentes al gen esp en diferentes genomas. Los resultados sugieren que existe una conservación de fragmentos más pequeños que la propia PAI completa, que podrían ser capaces de transferirse de manera independiente a la PAI mediante elementos móviles como transposasas. Sin embargo, debido a la variabilidad de las regiones adyacentes a esp, a la hora de diseñar el pMAD_Ent para mutar el gen, se tuvo en cuenta que el alelo mutante contase con las zonas más conservadas, en este caso, el principio y final del gen. Actualmente, se está llevando a cabo el proceso de mutagénesis, cuyo resultado final no podrá ser presentado en esta memoria por cuestiones de tiempo. En resumen, esta herramienta podría ser utilizada para modificar cualquier gen de E. faecalis sin dejar marcas de resistencia, incluso permitiría modificar secuencias a nivel de nucleótidos simples.