Identificación y producción de proteínas de Bacillus thuringiensis: evaluación de su actividad insecticída

Abstract

La bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis (Bt) es el microorganismo más empleado actualmente como materia activa en el desarrollo de bioinsecticidas y la construcción de plantas transgénicas (planta Bt) resistentes a los insectos. Todo ello se debe a su gran capacidad para producir una enorme variedad de proteínas con elevada toxicidad contra un amplio número de especies de insectos que suelen originar importantes plagas agrícolasGforestales o de interés médicoGveterinario. En este trabajo se ha analizado el genoma de la cepa L60 de B. thuringiensis serovar ibérica (BtibGL60) con el objetivo de identificar genes que codifiquen para nuevas proteínas con potencial actividad insecticida por si mismas o una posible acción sinérgica para otras proteínas insecticidas ya descritas. El resultado más relevante ha sido la identificación de 5 nuevos genes que codifican para proteínas con similitudes del 99 %, 56 %, 44 % y 51 % a las proteínas Bel_Enhancin, Cry32Ba1, Cry66Aa2 y Vip4Aa1, previamente descritas y, en virtud de lo cual, se prevé que puedan tener actividad insecticida. Todos estos genes, excepto uno (el homólogo a vip4Aa1), se han logrado expresar, pero sólo en uno de estos casos (el homólogo a cry32Ba1) se ha conseguido obtener la proteína en fase soluble. La proteína soluble Cry32Ba1, así como las proteínas solubles que componen el cristal BtibGL60 y las que se encuentran en el sobrenadante de la fermentación de esta cepa, han sido caracterizadas mediante bioensayos para determinar su actividad insecticida. Los bioensayos cualitativos realizados contra 7 especies del orden Lepidoptera (Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Mamestra brassicae, Chrysodeixis chalcites, Helicoverpa armigera, Ostrinia nubilalis y Lobesia botrana), una especie de Coleoptera (Leptinotarsa decemlineata) y una especie de Diptera (Ceratitis capitata) han revelado que ninguna de estas especies de insectos son susceptibles a ninguna de las proteínas evaluadas, excepto la moderada susceptibilidad mostrada por C. chalcites a la proteína Cry32Ba1 y por C. capitata a las proteínas del cristal de BtibGL60. Se discute el interés práctico y el alcance del estudio realizado dentro del campo de los bioinsecticidas microbianos

The most successful insect pathogen used for insect control is the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt), which represents most of the microorganisms used in biological control of agricultural pests in different cultures. This bacterium is the most promising bacterium for the production of bioinsecticides as well as plant resistant to insects associated with environmental preservation. All this is due to its capacity to produce a high variety of crystalline protein inclusions, upon sporulation, which are toxic to a large group of insects responsable for important pests worldwide. In the present study we analysed the genome of the strain L60 of Bacillus thuringiensis serovar iberica (BtibGL60) with the aim of identifying genes that encode for novel proteins with insecticidal properties or synergistic activity with other insecticidal proteins already catalogued. The most relevant result was the identification of 5 novel genes encoding for proteins with a percentage of similarity of 99 %, 56 %, 44 % and 51 % with Bel_Enhancin, Cry32Ba1, Cry66Aa2 and Vip4Aa1, respectively, that had been previously described as proteins with insecticidal properties. All these genes have been expressed, except the vip4Aa1 homolog, but only one of the proteins (the Cry32Ba1 homolog) was obtained in the soluble fraction. This protein, as well as the soluble crystalline protein inclusions, that compose the crystal itself, and the supernatant obtained in the fermentation process of this Bt strain, have been characterized by bioassays in order to determine their insecticidal activity. These qualitative bioassays were tested against 7 different species of Lepidopteran genre (Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Mamestra brassicae, Chrysodeixis chalcites, Helicoverpa armigera, Ostrinia nubilalis y Lobesia botrana), one species of Coleopteran genre (Leptinotarsa decemlineata) and one species of Dipteran genre (Ceratitis capitata), but no relevant toxicity results were obtained, except for a moderate susceptibility shown by C. chalcites to Cry32Ba1, on the one hand, and C. capitata to crystalline protein inclusions of BtibGL60, on the other hand. A further discussion of the relevance of these results as well as their future application is covered in this work