Study of the molecular mechanisms underlying Bap-mediated cell-cell interactions in Staphylococcus aureus

Abstract

La mayoría de los microorganismos son capaces de vivir en comunidades sésiles, siendo esta forma de crecimiento bastante más frecuente que la forma de vida planctónica. En estas comunidades microbianas, conocidas como biofilms, las células crecen adheridas a un sustrato y embebidas en una matriz exopolimérica que ellas mismas producen, y que confiere numerosas ventajas a la población: integridad estructural, protección ante factores externos, y control de la absorción de nutrientes. La composición de esta matriz extracelular es sumamente compleja, variando entre diferentes especies bacterianas y siendo muy susceptible a los cambios que puedan ocurrir en el ambiente circundante. Aproximadamente el 97% de la matriz es agua; el resto es una mezcla de nutrientes, metabolitos, productos de la lisis celular y polímeros secretados (polisacáridos, lípidos, DNA, proteínas). Staphylococcus aureus, una bacteria comensal y patógena causante de numerosas infecciones agudas y crónicas tanto en animales como en humanos, tiene la capacidad de desarrollar biofilms sobre una gran diversidad de superficies vivas e inertes. Esto representa para la bacteria un importante factor de virulencia que aumenta su persistencia y patogenicidad. Por ello, la sociedad científica ha dedicado grandes esfuerzos a lo largo de las ultimas décadas en descifrar la composición de la matriz extracelular estafilocócica, las características estructurales de sus elementos, así como las vías de regulación y los procesos moleculares que controlan su composición. Estudios recientes han puesto de manifiesto que las proteínas son uno de los componentes mayoritarios de la matriz extracelular de S. aureus, sin embargo, actualmente poco se sabe acerca de los aspectos relacionados con su organización espacial en la matriz del biofilm y de las interacciones moleculares con otros componentes de la matriz extracelular o de la célula huésped. En el presente trabajo, hemos estudiado los mecanismos moleculares mediante los cuales la proteína Bap (Biofilm associated protein) es capaz de inducir la interacción intercelular en S. aureus. Bap es una proteína de alto peso molecular que se encuentra anclada covalentemente a la superficie bacteriana mediante un mecanismo dependiente de la enzima sortasa. Hemos determinado que la proteína Bap interconecta células de S. aureus a través de un proceso de autoensamblaje que da lugar a agregados de tipo amiloide en respuesta a determinadas condiciones ambientales. Mas específicamente, nuestros resultados indican que Bap sufre un procesamiento en el que se liberan fragmentos que contienen la región N-terminal. Esta región tiene una conformación de tipo glóbulo fundido (molten-globule) que cambia a una estructura rica en láminas β cuando el pH se acidifica. El estado glóbulo fundido de los fragmentos N-terminales de Bap se caracteriza por poseer una estructura terciaria poco organizada. Sin embargo, cuando se organiza en laminas β tiene tendencia a polimerizar para formar fibras de tipo amiloide. La transición de Bap desde glóbulo fundido a lamina-β no ocurre en presencia de calcio. La unión del calcio a los dominios EF-hand presentes en la región N-terminal de Bap estabiliza la conformación de glóbulo fundido impidiendo la transición a lamina β y el subsecuente ensamblaje de las fibrillas amiloides. Estos resultados indican que Bap juega una doble función en el proceso de formación del biofilm, primero como sensor de condiciones ambientales externas, y segundo como modulo para la construcción de un andamiaje proteico que sustente la matriz del biofilm en determinadas situaciones ambientales. Este comportamiento multicelular dependiente de pH está conservado en proteínas Bap presentes en otros estafilococos coagulasa negativos. La existencia de proteínas homólogas a Bap en otras bacterias sugiere que este mecanismo de agregación amiloide como estrategia para formar la matriz del biofilm, está conservado en bacterias.

Community-based life style is very common in the microbial world and it happens to be more prevalent than the planktonic mode of growth. In these microbial communities, known as biofilms, cells grow adhered to a substrate and encased in a self-produced exopolymeric matrix, which gives several benefits to the population: it provides structural integrity, protection against external factors and controls nutrient adsorption. The complex composition of this extracellular matrix varies among different bacterial species and is susceptible to changes in the surrounding environment. Around 97% of the matrix is actually water; the rest is a complex of nutrients, metabolites, products from cell lysis and secreted polymers (polysaccharides, DNA, lipids and proteins). Staphylococcus aureus, a commensal as well as a major pathogen responsible for a wide range of serious acute and chronic diseases in humans and animals, has the capacity to reside in biofilms adhered to a plethora of alive and inert surfaces. For bacteria, this represents an important virulence factor that enhances their persistence and pathogenicity thus contributing to the success of the pathogen in both healthcare and community settings. For this reason, the scientific society have dedicated a lot of effort over the past few decades to elucidate the composition of staphylococcal extracellular matrix, the structural features of its elements and the regulatory pathways as well as the molecular processes that control its composition. Recent studies have revealed that proteins are one of the major components of the S. aureus extracellular matrix, although their spatial organization and molecular interactions within a biofilm remain in most cases largely unknown. In the present work, we have studied the molecular mechanism by which Bap (Biofilm associated protein) mediates interbacterial interactions during biofilm development in S. aureus. Bap is a high molecular weight multi-domain protein that is localized at the bacterial cell surface by a covalent sortase-dependent mechanism. We have determined that the protein connects staphylococcal cells through a self-assembly process resulting in the formation of amyloid-like aggregates that build up the biofilm matrix in response to environmental conditions. Specifically, our results indicate that Bap undergoes partial proteolytic cleavage during which fragments containing the N-terminal region are released. This region has a molten globule-like conformation that, when the pH becomes acidic, switch to a β-sheet-rich form. The molten globule-like state of Bap fragments is characterized by a not-well defined tertiary structure. However, when it organizes into β-sheets, it is capable of polymerize to form amyloid-like fibers. Calcium binding to the EF-hand motifs present in the N-terminal region of Bap stabilizes the molten globule conformation preventing β-sheet transition and the subsequent self-assembly into amyloid fibers. These findings define a dual function for Bap, first as a sensor of environmental external signals and second, as a scaffold protein that promotes biofilm development in defined settings. Since the pH-driven multicellular behavior mediated by Bap occurs in coagulase-negative staphylococci, and many other bacteria exploit Bap-like proteins to build a biofilm matrix, the mechanism of amyloid-like aggregation described in the present work may be widespread among bacteria.