Urrutia Vera, OlaiaMendizábal Aizpuru, José AntonioJiménez Montenegro, Lucía2025-10-012025-10-0120252025-09-1910.48035/Tesis/2454/55092https://academica-e.unavarra.es/handle/2454/55092En los últimos años ha aumentado el interés por la leche que contiene exclusivamente beta-caseína A2 (β-caseína A2), conocida como leche A2, debido a sus posibles beneficios para la salud humana. Como consecuencia, este producto ha ganado presencia en los mercados internacionales y muchos ganaderos han comenzado a orientar la selección de sus rebaños hacia animales con genotipo A2A2. Esta tesis doctoral contribuye al avance del conocimiento científico y técnico sobre las bases moleculares de la producción de leche A2 y su autentificación. Para ello, se adoptó una estrategia multidisciplinar que incluyó: (a) el análisis del panorama científico en torno a la leche A2; (b) el desarrollo de métodos moleculares para la detección alélica y la autentificación de la leche; y (c) el estudio de la expresión génica y la regulación postranscripcional en la glándula mamaria de vacas con distintos genotipos de β-caseína (A1A1 vs. A2A2) durante la lactación. En primer lugar, se realizó un análisis bibliométrico para evaluar el estado del arte sobre la leche A2. La mayoría de los estudios se centraban en su impacto sobre la salud humana, especialmente en relación con la β-casomorfina-7 (BCM-7), un péptido bioactivo que se libera durante la digestión de la β-caseína A1. Una proporción significativa de publicaciones procedía de Australia y Nueva Zelanda, en parte debido al impulso de una empresa multinacional que ha promovido o financiado muchos de los trabajos que apoyan el consumo de β-caseína A2. Aunque el número de publicaciones ha aumentado en los últimos años, la mayoría son artículos de revisión que suelen concluir que los productos derivados de A2 podrían ser preferibles a los de A1. Sin embargo, el número de ensayos clínicos en humanos sigue siendo limitado, lo que pone de manifiesto la necesidad de disponer de evidencias científicas más rigurosas e independientes. La comercialización de leche A2 requiere sistemas de control de calidad fiables para evitar fraudes. Por ello, en esta tesis, se desarrolló un ensayo de qPCR dúplex con sondas LNA para la detección directa de los alelos A1 y A2 en muestras de leche, permitiendo así su autentificación. Dado el estrecho ligamiento entre los genes de las caseínas en el cromosoma 6, y la relevancia tecnológica de la κ-caseína, se diseñaron además dos ensayos de qPCR dúplex para el genotipado de los alelos A, B y E del gen CSN3 (κ-caseína). Estas herramientas moleculares demostraron ser rápidas, sensibles y fiables tanto para el genotipado en ganado bovino como para la autentificación de leche. La selección genética para el genotipo A2A2 podría tener efectos indirectos sobre la expresión génica y las rutas moleculares implicadas en la síntesis y composición de la leche. Aunque los genes de las caseínas no son elementos reguladores en sí mismos, las variantes genéticas en estos loci podrían estar asociadas a cambios en la expresión génica en la glándula mamaria, ya sea por ligamiento con elementos reguladores cercanos o mediante mecanismos más complejos. Por ello, se analizó si el genotipo de β-caseína (A1A1 vs. A2A2) conlleva diferencias transcriptómicas en la glándula mamaria de vacas durante la fase de lactación. Las muestras de leche se recogieron siguiendo un protocolo basado en la congelación inmediata en nitrógeno líquido, una estrategia especialmente adecuada para condiciones de campo, ya que preserva la integridad del ARN sin necesidad de procesamiento inmediato en el laboratorio. El ARN extraído de los glóbulos grasos de leche (MFG) presentó una calidad e integridad adecuadas, y las lecturas de RNA-seq superaron todos los controles de calidad, lo que confirmó la viabilidad del uso de estas muestras de ARN para el análisis transcriptómico de la glándula mamaria. Para caracterizar las diferencias transcriptómicas entre genotipos, se llevaron a cabo dos niveles de análisis: uno a nivel génico, evaluando los niveles globales de expresión de cada gen, y otro más específico a nivel de isoformas de mRNA, que permite identificar variantes transcritas que se generan a partir de un mismo gen principalmente mediante eventos de splicing alternativo. Aunque el análisis a nivel génico mostró pocas diferencias relevantes, el análisis complementario a nivel de isoformas reveló 3.454 isoformas de ARN mensajero (mRNA) diferencialmente expresadas. El análisis funcional de estas isoformas sugiere que, en vacas A2A2, estos cambios podrían estar relacionados con disfunción mitocondrial, alteraciones en el metabolismo lipídico y un aumento del estrés celular. Estos resultados ponen de manifiesto el valor añadido del análisis a nivel de isoformas en estudios de RNA-seq, ya que permite detectar diferencias regulatorias y funcionales no evidentes a nivel de gen, pero que podrían contribuir a la variabilidad fenotípica. La existencia de estas diferencias post-transcripcionales entre vacas A1A1 y A2A2 podría tener implicaciones en el contexto de la selección genética para la variante A2 de la β-caseína, y subraya la necesidad de seguir explorando sus posibles consecuencias funcionales y su impacto en la síntesis y composición de la leche de la leche de vaca.In recent years, interest in milk containing only A2 beta-casein (β-casein), also known as A2 milk, has increased due to its potential benefits for human health. As a result, this product has gained presence in international markets, and many farmers have started breeding dairy herds towards A2A2 animals. This doctoral thesis contributes to the advancement of scientific and technical knowledge related to molecular basis of A2 milk production and its authentification. To achive this, a multidisciplinary strategy was adopted, including: (a) the analysis of the scientific landscape surrounding A2 milk; (b) the development of molecular methods for allele detection and milk authentication; and (c) the investigation of gene expression and post-transcriptional regulation in the mammary gland of cows with different β-casein genotypes (A1A1 vs. A2A2) during lactation. First, a bibliometric analysis was conducted to evaluate the state of the art on A2 milk. Most studies focused on human health, with particular emphasis on the potential issues associated with β-casomorphin-7 (BCM-7), a bioactive peptide released during A1 β-casein digestion. A significant proportion of publications originated in Australia and New Zealand, largely due to the influence of a multinational company, which has promoted and/or sponsored many of the studies examining the positive effects of A2 β-casein consumption on human health. Although the number of publications has increased in recent years, most of them are review articles that generally conclude A2-related products may be preferable to A1. However, the number of clinical trials in humans remains limited, highlighting the need for more independent and rigorous scientific evidence. A2 milk marketing requires accurate quality control to prevent possible fraud. Therefore, in this thesis, a duplex real-time polymerase chain reaction (qPCR) assay using locked nucleic acid (LNA) probes was developed for the direct detection of A1 and A2 alleles in milk samples, allowing product authentication. Due to the close linkage between casein genes on chromosome 6, which are often inherited as haplotypes, and considering the technological importance of κ-casein, two duplex qPCR assays for the genotyping of κ-casein (CSN3) alleles A, B, and E were also developed. These molecular tools proved to be rapid, sensitive, and reliable for cattle genotyping and milk authentication. Selective breeding for A2A2 genotype may have indirect effects on gene expresión and molecular pathways involved in milk synthesis and composition. Although casein genes are not regulatory elements themselves, genetic variation within these loci might be indirectly associated with gene expression changes in the mammary gland, either through linkage with nearby regulatory elements or through more complex upstream regulatory mechanisms. Therefore, we investigated whether the β-casein genotype (A1A1 vs. A2A2) is associated with transcriptomic differences in the lactating mammary gland. Milk samples were collected using a sampling protocol based on immediate freezing in liquid nitrogen. This approach is well-suited for field conditions, as it preserves RNA integrity, without requiring inmediate processing in the laboratory. The RNA extracted from milk fat globules (MFG) exhibited adequate quality and integrity, and the RNA-seq reads met all quality control standards, supporting the feasibility of using these samples for mammary gland transcriptome analysis. To gain a comprehensive understanding of transcriptomic differences, we analysed gene-level expression and isoform-level expression (alternative splicing events) between both genotypes. While gene-level differential expression analysis revealed minimal differences between genotypes, the complementary analysis of alternative splicing events identified 3,454 differentially expressed messenger RNA (mRNA) isoforms. Functional enrichment of the DE mRNA isoforms revealed that, in A2A2 cows, these changes may be associated with mitochondrial dysfunction, altered lipid metabolism and increased cellular stress. These findings underscore the added value of isoform-level resolution in RNA-Seq studies, particularly in revealing regulatory and functional differences not evident at the gene level that could contribute to phenotypic variation. The presence of these subtle post-transcriptional regulatory differences between A1A1 and A2A2 cows, may be of interest in the context of ongoing selective breeding for the A2 β-casein variant and highlights the need to explore the functional or phenotypic consequences and their potential impact on milk synthesis and composition in dairy herds.270 p.application/pdfengCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0)Variantes proteicas de la lecheBeta-caseína A2Genotipo A2A2Control de calidadSelección genéticaAutentificaciónMilk protein variantsA2 beta-caseinA2A2 genotypeQuality controlSelective breedingAuthenticationinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccess