Obtención de un alelo de celulosa sintetasa capaz de producir celulosa en ausencia del activador alostérico c-di-GMP

Abstract

La celulosa es uno de los principales componentes de la matriz extracelular de los biofilms formados por algunas especies bacterianas. Los genes involucrados en su síntesis, en el caso de Salmonella Enteritidis, se encuentran recogidos en dos operones denominados bcsABZC y bcsEFG. De todos estos genes caben destacar bcsA y bcsB, que forman un complejo interno de membrana que es suficiente para que se produzca la síntesis in vitro del polímero. La activación de bcsA para iniciar la síntesis de celulosa requiere la presencia del mensajero secundario c-di-GMP, que activa de forma alostérica a la enzima al interaccionar con su dominio PilZ. En este estudio se ha planteado producir una celulosa sintetasa capaz de sintetizar celulosa sin necesidad de unir c-di-GMP. Esta nueva enzima permitiría optimizar el proceso de producción de celulosa para aplicaciones industriales y biomédicas. En el estudio hemos utilizado dos aproximaciones, mutaciones aleatorias en el dominio PilZ y mutagénesis dirigida sobre la arginina de la posición 696 de bcsA, mutación que durante la realización de este trabajo se ha descrito causa in vitro la activación constitutiva de la celulosa sintetasa de Rhodobacter sphaeroides. Las diferentes variantes del gen bcsA se han clonado en un plásmido bajo un promotor inducible y su actividad se ha analizado en una cepa de Salmonella enteritidis deficiente en c-di-GMP. Los resultados han mostrado que ninguna de las variantes obtenidas por mutación aleatoria han dado lugar a un alelo constitutivamente activo de BcsA y la mutación dirigida en la arginina de la posición 696 provoca la inactivación de la celulosa sintetasa de Salmonella.

Cellulose is one of the main extracellular matrix components in biofilms produced by bacteria. Genes involved in its synthesis, in Salmonella Enteritidis, are clustered in two operons called bcsABZC and bcsEFG. From these genes it is worth to remark bcsA and bcsB, that form an inner membrane complex which is sufficient for the in vitro synthesis of the polymer. The presence of the c-di-GMP is necessary for the synthesis because this molecule allosterically activates the cellulose synthase by interacting with the PilZ domain of the BcsA subunit. The aim of this study has been to generate a cellulose synthase variant able to activate cellulose synthesis in the absence of c-di-GMP. This new enzyme might provide important benefits to optimize the production of cellulose for industrial and biomedical applications. To accomplish this aim, two different approaches have been used: random mutations along PilZ domain of bcsA, and site directed mutagenesis of the arginine at the 696 position of BcsA. This last mutation has been shown to cause in vitro the constitutive activation of the cellulose synthase of Rhodobacter sphaeroides. Different versions of bcsA gene have been cloned into a plasmid under the control of an IPTG-inducible promoter, and have been used to complement a Salmonella strain devoid of c-di-GMP. The results have shown that none of variants obtained by random mutagenesis was active in the absence of c-di-GMP and targeted mutation of the arginine at position 696 renders the cellulose synthase of Salmonella inactive.