Obtención de un alelo de celulosa sintetasa capaz de producir celulosa en ausencia del activador alostérico c-di-GMP
Date
2014Author
Advisor
Version
Acceso abierto / Sarbide irekia
Type
Trabajo Fin de Máster/Master Amaierako Lana
Impact
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nodoi-noplumx
|
Abstract
La celulosa es uno de los principales componentes de la matriz extracelular de
los biofilms formados por algunas especies bacterianas. Los genes involucrados en su
síntesis, en el caso de Salmonella Enteritidis, se encuentran recogidos en dos operones
denominados bcsABZC y bcsEFG. De todos estos genes caben destacar bcsA y bcsB,
que forman un complejo interno de membrana que es suficiente ...
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La celulosa es uno de los principales componentes de la matriz extracelular de
los biofilms formados por algunas especies bacterianas. Los genes involucrados en su
síntesis, en el caso de Salmonella Enteritidis, se encuentran recogidos en dos operones
denominados bcsABZC y bcsEFG. De todos estos genes caben destacar bcsA y bcsB,
que forman un complejo interno de membrana que es suficiente para que se produzca la
síntesis in vitro del polímero. La activación de bcsA para iniciar la síntesis de celulosa
requiere la presencia del mensajero secundario c-di-GMP, que activa de forma
alostérica a la enzima al interaccionar con su dominio PilZ.
En este estudio se ha planteado producir una celulosa sintetasa capaz de
sintetizar celulosa sin necesidad de unir c-di-GMP. Esta nueva enzima permitiría
optimizar el proceso de producción de celulosa para aplicaciones industriales y
biomédicas. En el estudio hemos utilizado dos aproximaciones, mutaciones aleatorias
en el dominio PilZ y mutagénesis dirigida sobre la arginina de la posición 696 de bcsA,
mutación que durante la realización de este trabajo se ha descrito causa in vitro la
activación constitutiva de la celulosa sintetasa de Rhodobacter sphaeroides. Las
diferentes variantes del gen bcsA se han clonado en un plásmido bajo un promotor
inducible y su actividad se ha analizado en una cepa de Salmonella enteritidis deficiente
en c-di-GMP. Los resultados han mostrado que ninguna de las variantes obtenidas por
mutación aleatoria han dado lugar a un alelo constitutivamente activo de BcsA y la
mutación dirigida en la arginina de la posición 696 provoca la inactivación de la
celulosa sintetasa de Salmonella. [--]
Cellulose is one of the main extracellular matrix components in biofilms
produced by bacteria. Genes involved in its synthesis, in Salmonella Enteritidis, are
clustered in two operons called bcsABZC and bcsEFG. From these genes it is worth to
remark bcsA and bcsB, that form an inner membrane complex which is sufficient for the
in vitro synthesis of the polymer. The presence of the c-di-GM ...
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Cellulose is one of the main extracellular matrix components in biofilms
produced by bacteria. Genes involved in its synthesis, in Salmonella Enteritidis, are
clustered in two operons called bcsABZC and bcsEFG. From these genes it is worth to
remark bcsA and bcsB, that form an inner membrane complex which is sufficient for the
in vitro synthesis of the polymer. The presence of the c-di-GMP is necessary for the
synthesis because this molecule allosterically activates the cellulose synthase by
interacting with the PilZ domain of the BcsA subunit.
The aim of this study has been to generate a cellulose synthase variant able to
activate cellulose synthesis in the absence of c-di-GMP. This new enzyme might
provide important benefits to optimize the production of cellulose for industrial and
biomedical applications. To accomplish this aim, two different approaches have been
used: random mutations along PilZ domain of bcsA, and site directed mutagenesis of
the arginine at the 696 position of BcsA. This last mutation has been shown to cause in
vitro the constitutive activation of the cellulose synthase of Rhodobacter sphaeroides.
Different versions of bcsA gene have been cloned into a plasmid under the control of an
IPTG-inducible promoter, and have been used to complement a Salmonella strain
devoid of c-di-GMP. The results have shown that none of variants obtained by random
mutagenesis was active in the absence of c-di-GMP and targeted mutation of the
arginine at position 696 renders the cellulose synthase of Salmonella inactive. [--]
Subject
Celulosa,
C di GMP,
Salmonella,
Cellulose
Degree
Máster Universitario en Agrobiotecnología /
Unibertsitate Masterra Agrobioteknologian