Efecto de las enhancinas sobre las propiedades insecticidas de los baculovirus

Abstract

El objetivo del presente trabajo fue caracterizar molecularmente una enhancina (VEF, virus enhancing factor) localizada en el genoma de un granulovirus de Agrotis segetum (AgseGV) aislado en Badajoz y determinar su efecto sobre la actividad insecticida del Alphabaculovirus de Autographa californica (AcMNPV) para distintas especies de insectos susceptibles. La enhancina de AgseGV presentó un 99% de identidad con la enhancina de otro aislado del AgseGV de China (AY522332) mientras la identidad con las VEFs localizadas en el NPV de A. segetum AgseNPV (DQ123841) sólo fue del 24-28%. Las VEFs del AgseGV y del AgseNPV presentan una valina (HVMGH) y una alanina (HAISF), respectivamente, en el motivo de unión a zinc en vez del característico ácido glutámico (HEXXH) de las metaloproteasas lo que sugiere que carezcan de funcionalidad. Para determinar su posible funcionalidad se construyeron recombinantes mediante el sistema Bac-to-Bac con el AcMNPV, y las VEFs del AgseGV (BacENHAgseGV) y del AgseNPV (BacVEF1AgseNPV, BacVEF2AgseNPV y BacVEF3AgseNPV). La incorporación del gen de la enhancina de AgseGV en BacENHAgseGV se comprobó mediante PCR, análisis de restricción y secuenciación; sin embargo, no se detectó expresión génica en células Sf21 infectadas con el BacENHAgseGV. El análisis de los componentes proteicos de OBs recombinantes en geles de SDS-PAGE tampoco reveló la presencia de bandas del tamaño correspondiente al de las enhancinas (100-115 kDa). Este dato sugiere que no ha habido síntesis de la enhancina o que si ha habido síntesis no se ha incorporado a los OBs. Finalmente, se cuantificó la actividad insecticida de los recombinantes en larvas L2 y L4 de distintas especies de lepidópteros. En ninguna de las especies ensayadas se pudo apreciar una mejora de la actividad insecticida de los virus recombinantes, mientras que en el control positivo, Bacᴓ al que se añadió Tinopal UNPA-GX, si hubo una mejora significativa de la actividad biológica del virus para las larvas L4. En base a los resultados obtenidos, podríamos concluir que los baculovirus recombinantes no expresan las correspondientes enhancinas, lo cual sugiere la necesidad de abordar la construcción de nuevos recombinantes que contemplen la inclusión de los promotores nativos de los genes de las enhancinas que se quieran expresar

The aim of the present study was to achieve a molecular characterization of an enhancin gene (VEF, virus enhancing factor) located in the genome of the Agrotis segetum granulovirus (AgseGV) isolated in Badajoz and to determine its effect in the insecticidal activity of the Autographa californica Alphabaculovirus (AcMNPV) for different susceptible insect species. The AgseGV enhancin showed a 99% identity to the enhancin of the Chinese isolate of AgseGV, whereas the identity to the VEFs of A. segetum NPV AgseNPV (DQ123841) was only of 24-28%. The AgseGV and AgseNPV VEFs present a valine (HVMGH) and an alanine (HAISF) residue, respectively, in the zinc-binding domain instead of the metalloproteases’ characteristic glutamic acid (HEXXH), which may suggest a lack of functionality. To determine their possible functionality, AcMNPV recombinants were constructed using the Bac-to-Bac system that included the VEFs from the AgseGV (BacENHAgseGV) and AgseNPV (BacVEF1AgseNPV, BacVEF2AgseNPV and BacVEF3AgseNPV). The integration of the AgseGV enhancin gene into the BacENHAgseGV was confirmed by PCR, restiction enzyme analysis and sequencing. However, no gene expression was detected in Sf21 cells infected with the BacENHAgseGV. Analysis of the protein components of recombinant OBs by SDS-PAGE neither revealed the presence of protein bands of the expecetd size of the enhancins (100-115 kDa). This data suggests a lack of enhancin synthesis or if it has been synthetised it has not been incorporated into the OBs. Finally, insecticidal activity of recombinant viruses was quantified in L2 and L4 instar of different lepidopteran species. In none of the insects tested, an improvement of insecticidal activity was observed while the positive control, Bacᴓ in which Tinopal UNPAGX was added, showed a significative increased of the viral activity in L4 instar. According to the results obtained in the present work, we could conclude that recombinant viruses do not express the corresponding enhancins, suggesting the need to considered the construction of new recombinats that include the enhancin native promoters