Obtencion de plantas transplastómicas de tabaco con sobreexpresión de mutantes redox de Tiorredoxina F o M

Abstract

Las tiorredoxinas (Trxs) son tiol-disulfuro oxidorreductasas que ceden electrones a sus proteínas diana oxidadas reduciéndolas, ejerciendo así una regulación post-traduccional y modulando su actividad. Además, las Trxs f y m tienen actividad chaperona, fundamental para el correcto plegamiento de determinadas proteínas. La sobreexpresión de la Trx f desde el genoma plastidial de tabaco incrementó el contenido de almidón en sus hojas, mientras que la sobreexpresión de la Trx m supuso mayor tolerancia al metil-viológeno. El objetivo de este trabajo fue dilucidar si estos fenotipos eran debidos a la actividad reductasa o chaperona de dichas Trxs. Para ello, se generaron mutantes de la Trx f en el centro activo o en la Cys71 y de la Trx m en el centro activo (las mutaciones suponían el cambio de cisteínas por serinas) y se transformó plastidialmente tabaco con los genes correspondientes. Después se regeneraron plantas que, teóricamente, incluían el correspondiente gen mutado. Los análisis moleculares revelaron que todos los regenerantes eran escapes y no incluían el transgén. También se transformaron plantas de tabaco con un vector específico de patata que contenía la Trx f para comprobar si las diferencias en las zonas de recombinación homóloga entre tabaco y patata no eran un obstáculo para que se diera dicha recombinación. Se obtuvo un regenerante positivo confirmado por Southern y Western Blot. Esto permitirá comprobar en tabaco que los vectores de transformación de patata están correctamente construidos como paso previo a la transformación de patata que tiene una duración mucho mayor

Thioredoxins (Trxs) are thiol-disulfide oxidoreductases that donate electrons to their target by reducing oxidized proteins, thus exerting a post-translational regulation and modulating its activity. In addition, the Trxs f and m have chaperone activity, essential for the correct folding of certain proteins. Over expression of Trx f from the plastid genome of tobacco increased starch content in leaves, while overexpression of the Trx m increased tolerance to methyl viologen.The aim of this study was to elucidate whether these phenotypes were due to the reductase or chaperone activity of these Trxs. To do this, Trx f mutants were generated in the active center or in the Cys 71 and Trx m in the active center (mutations involve changing cysteine to serine) and the plastid genome of tobacco was transformed with the corresponding genes. After the transformation process regenerated shoots theoretically included the corresponding mutated genes. Molecular analyses revealed that all the regenerants were escapes and did not include the transgene. Tobacco plants were also transformed with a specific vector of potato including Trx f gene, to test whether the differences in the regions for homologous recombination between tobacco and potato were an obstacle for the recombination to proceed. One positive regeneration confirmed by Southern and Western Blot was obtained. This will allow checking in tobacco that potato transformation vectors are correctly constructed as a previous step to the potato transformation, which has a much longer duration