Análisis funcional del factor de transcripción ERF10 en la simbiosis Medicago truncatula – Sinorhizobium medicae

Abstract

Las leguminosas constituyen uno de los taxones agrícolas más importantes del mundo debido a la capacidad de establecer relaciones simbióticas con bacterias del suelo pertenecientes al género Rhizobium. Estas plantas proporcionan una importante fuente de proteínas para los seres humanos y los animales, y además producen más de 100 millones de toneladas de nitrógeno fijado anualmente y son una parte vital del ciclo del nitrógeno global. Asimismo, se estima que la fijación biológica del nitrógeno (FBN) corresponde a más de la mitad del nitrógeno utilizado en agricultura. La provisión de nitrógeno fijado permite el crecimiento de las plantas huésped en suelos que de otra manera estarían limitados por el nitrógeno, y simultáneamente reduce la pérdida de nitrógeno por desnitrificación y lixiviación. En el presente estudio, se ha utilizado la especie Medicago truncatula, una leguminosa diploide anual. Esta planta presenta unas características tales como un genoma pequeño (5 x 108 pb), capacidad de autofecundación, una prolífica producción de semillas o un rápido tiempo de generación que hacen de ella un buen modelo para la investigación. Además, es una leguminosa de la familia de la alfalfa y los conocimientos adquiridos pueden ser transferidos a una especie de interés agrícola en Europa. El objetivo de este trabajo es analizar el papel del gen erf10 en la simbiosis M. truncatula – S. medicae en un estudio transcriptómico, se clasificó como inducible o de respuesta a los factores de nodulación. Dicho gen pertenece a la familia AP2/ERF, de la cual han sido descritos varios miembros. Para analizar el papel de este gen en la simbiosis Medicago truncatula – Sinorhizobium medicae se obtuvieron una línea con inserción Tnt1 en dicho gen denominada ERF10. La línea mutante se cultivó junto a una línea de M. truncatula silvestre denominada R108. Ambas líneas se cultivaron en simbiosis con bacterias Sinorhizobium medicae ABS7M que expresaban el gen LacZ. Se compararon las plantas ERF10 con las plantas control para conocer cómo la mutación del gen erf10 puede afectar al desarrollo de las plantas. Para ello se realizó una primera comparación de la biomasa y el número de nódulos de ambas líneas y posteriormente se procedió a la comparación de los nódulos y los cordones de infección. En primer lugar, se realizó una tinción con X-Gal para identificar la bacteria, tras lo que se procedió a las observaciones de nódulos enteros y nódulos cortados con ayuda de una cuchilla a la lupa. Posteriormente, se observaron al microscopio óptico los cordones de infección. Y, por último, se puso a punto el método para obtener cortes de los nódulos de 5 micras de ancho a los que se realizó una segunda tinción con rojo de ruterio y se observaron al microscopio óptico.En primer lugar, se verificó la presencia del Tnt1 en las plantas ERF10 y del análisis in silico de la expresión del gen erf10 se extrajo que dicho gen se expresa alrededor de las 6 horas tras la infección y es regulado negativamente por el etileno. De la comparación de ambas líneas de plantas se extrajeron resultados interesantes. Se observaron diferencias significativas en la comparación de la biomasa tanto de la parte aérea como de la raíz. Los cordones de infección de las plantas ERF10, además de observarse en gran número, fueron incompletos y anormales. Y al comparar las imágenes de los cortes de los nódulos también se apreciaron diferencias en la estructura de las células, la presencia de vacuolas y el número de gránulos de almidón entre las plantas mutantes y las control