Innate immunity against small ruminant lentiviruses (SRLV): characterization of APOBEC3-derived restriction

Abstract

En esta tesis se han llevado a cabo los siguientes estudios: 1. Identificación y caracterización de la restricción por APOBEC3 ovino frente a los SRLV. Se han estudiado dos tipos celulares que muestran restricción natural frente a los SRLV, monocitos y macrófagos-M1, identificando la isoforma Z1 como la más expresada, entre las proteínas APOBEC3 ovinas. En la caracterización genética de A3Z1 se ha identificado una isoforma adicional resultante de splicing alternativo, también presente en el transcriptoma humano y que carece del dominio citidín desaminasa (A3Z1Tr) característico de este tipo de proteínas. La expresión de estas proteínas se induce tanto tras la incubación con IFN-ɣ como con la infección viral. Ambas son resistentes a la degradación por Vif de SRLV y pueden encapsidarse en los viriones. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha podido determinar que ambas proteínas pueden interactuar entre sí así como con Vif viral, a pesar de la resistencia que presentan a su degradación. La expresión endógena de A3Z1 en células en cultivo tipo fibroblasto (T-immortalized goat epitelial fibroblasts, TIGEF) tan solo ha sido posible empleando estrategias de expresión transitoria, ya que los intentos de expresión permanente resultaban en cultivos abortivos. Las células TIGEF que expresan A3Z1 muestran una menor producción de SRLV. Ensayos de infectividad de un solo ciclo (single cycle infection) con vectores virales basados en HIV-1, MLV y SIV indican que A3Z1 ovino es capaz de inhibir la infectividad de dichos vectores. El mecanismo de restricción parece implicar la actividad citidín desaminasa en el contexto GA/AA. En ambos casos, la co-expresión de la isoforma truncada mitiga la restricción, probablemente por competición estérica con la proteína nativa en el interior de los viriones. 2. Caracterización de las vías de degradación de APOBEC3. Se ha investigado la capacidad de A3Z1 de restringir la infección con estirpes de SRLV que codifican la proteína Vif. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha podido comprobar que CYPA y no CBF-β es el cofactor necesario para la degradación de las proteínas APOBEC3 ovinas, requisito esencial en el caso de A3Z1 y A3Z1Tr. Concentraciones altas de CYPA permiten la degradación de A3Z1 por parte de Vif en diferentes tipos celulares, promoviendo así la infección por lentivirus. Sin embargo, no se alcanzan los niveles basales de A3Z1 empleando inhibidores del proteasoma y la degradación se produce también en presencia de Vif mutado, incapaz de reclutar el complejo ubiquitín ligasa y degradar así proteínas por la vía proteasomal, abriendo la posibilidad a la existencia de vías alternativas que permitan degradar A3Z1. Tan solo la combinación de inhibidores del proteasoma junto con inhibidores de la autofagia conseguían restablecer los niveles basales de A3Z1 sugiriendo la implicación de ambas vías. Además, la inhibición de la autofagia parece perjudicar la infección por SRLV, sugiriendo que la inducción podría favorecerla. 3. Estimulación de la respuesta innata ovina a través de la infección con vectores virales basados en el virus murino Sendai. La infección de células ovinas con un vector viral basado en el virus Sendai que codifica la proteína verde fluorescente (SeV-GFP) ha resultado ser del 100%, incluso en macrófagos de distintos orígenes. Sin embargo, la infección con SeV-GFP no se transmite en células ovinas y el vector es no replicativo. La infección con SeV-GFP ha activado una programación diferente dependiendo del tipo celular ovino, siendo la inducción de A3Z1 en células mieloides de especial importancia. La infección con SRLV y la producción de virus se encontraba disminuida en estas células tras el tratamiento con el vector viral. Los sobrenadantes procedentes de estos cultivos eran capaces de transmitir la restricción a células frescas, probablemente debido a la producción de interferón de tipo 1, sugiriendo que podría ser de utilidad en futuras estrategias de inmunización. La restricción también se ha observado frente a vectores basados en lentivirus, como HIV o SIV.

Different studies have been carried out in this thesis: 1. Identification and characterization of the restriction exerted by ovine APOBEC3 against SRLV. Two cellular types that show natural restriction against SRLV have been studied, monocytes and M1-macrophages, identifying the Z1 isoform as the most expressed, among the ovine APOBEC3 proteins. In the genetic characterization of A3Z1, an additional isoform resulting from alternative splicing, also present in the human transcriptome, was described. This new isoform lacks the citidin deaminase domain (A3Z1Tr), characteristic of this type of proteins. Both A3Z1 proteins were induced after incubation with IFN-γ as well as after viral infection, are resistant to Vif SRLV degradation and can be incorporated into virions. Through immunoprecipitation assays we have been able to determine that both A3Z1 proteins can interact, as well as with viral Vif, in spite of their resistance to degradation. A3Z1 endogenous expression in fibroblast type cells (T-immortalized goat epitelial fibroblasts, TIGEF) has only been possible using transient expression strategies, because permanent expression experiments resulted in aborted cultures. TIGEF cells that transiently express A3Z1 show a lower SRLV production. Single cycle infectivity trials with viral vectors based on HIV-1, MLV and SIV showed that ovine A3Z1 is able to inhibit the aforementioned vectors. The restriction mechanism seem to be citidin deaminase dependent in the GA/AA context. In both cases, the co-expression of the truncated isoform mitigates the restriction, probably by steric competition with the native protein inside the virions. 2. Characterization of APOBEC3 degradation pathways. The ability of A3Z1 to restrict SRLVs encoding the Vif protein has been investigated. Through immunoprecipitation assays it has been possible to confirm that CYPA, and not CBF-β is the cofactor for the optimal degradation of ovine APOBEC3, an essential requirement in the case of A3Z1 and A3Z1Tr. High concentrations of CYPA allowed the degradation of A3Z1 by Vif in different cell types, thus promoting lentivirus infection. However, A3Z1 basal levels were not restored when proteasome inhibitors were used. Furthermore, degradation also happened in the presence of a mutated Vif, unable to recruit the ubiquitin ligase complex and degrade proteins by the proteasome pathway, opening alternative pathways to degrade A3Z1. The combination of proteasome and autophagy inhibitors was able to restore A3Z1 basal levels, suggesting the involvement of both pathways. In addition, autophagy inhibition seems to impair SRLV infection, suggesting that induction could be a virus promoting mechanism. 3. Stimulation of innate immune response through murine Sendai virus vectors. The infection of ovine cells with a Sendai virus vector that encodes the green fluorescent protein (SeV-GFP) has been obtained at the 100% level, even in macrophages from different origins. However, SeV-GFP was a non-replicative vector and infection was not transmitted among ovine cells. Infection with SeV-GFP induced a different activation depending on the cell type, being the induction of A3Z1 in myeloid cells of special importance. Infection with SRLV as well as virus production were reduced in these cells after treatment with the viral vector. Supernatants from SeV infected cell cultures were able to transmit the restriction to fresh cells, likely due to type I IFN production, suggesting the potential application of this vector in future immunization strategies. The restriction has also been observed against lentivirus-based vectors from HIV or SIV.