New insights in the regulation of the shikimate pathway after quinate as plyphosate enhancer in Amaranthus palmeri

Abstract

El glifosato es el herbicida más empleado a nivel mundial. Su mecanismo de acción es la inhibición de la enzima 5‐enolpiruvilsiquimato‐3‐fosfato sintasa (EPSPS), enzima clave dentro de la ruta de biosíntesis de los amino ácidos aromáticos, también conocida como la ruta del siquimato. Uno de los procesos fisiológicos descritos tras la aplicación de este herbicida es la acumulación de quinato, un metabolito secundario, formado a partir de una ramificación lateral de la ruta del siquimato. Tras detectar efectos fisiológicos por la aplicación de quinato exógeno de forma aislada, se planteó la posibilidad de utilización de este compuesto como potenciador del glifosato para reducir las dosis de herbicida en el control de la mala hierba Amaranthus palmeri. En esta especie se han desarrollado poblaciones resistentes a glifosato, entre las cuales se encuentra el mecanismo de resistencia de sobreexpresión del gen EPSPS, lo que lleva a una sobreexpresión del enzima diana del herbicida. El principal objetivo de esta tesis fue el de profundizar en las alteraciones de la ruta del siquimato por el herbicida glifosato y el uso del quinato como potenciador de este herbicida en el control de plantas de A. palmeri sensibles y resistentes a glifosato (por amplificación génica). En este trabajo se determinó que la aplicación de quinato un día después del glifosato (tratamiento combinado) convertía en letal una dosis sub‐letal de herbicida en la población sensible. Estos resultados abren la posibilidad de aplicar ambos compuestos para mejorar la eficacia del herbicida y de reducir las dosis a aplicar en el control de poblaciones sensibles. La mayor toxicidad del tratamiento combinado estuvo relacionada con la exacerbación en los marcadores fisiológicos previamente descritos para este herbicida (acumulación del contenido de siquimato y de aminoácidos libres). Se estudió el comportamiento de la ruta del siquimato tras el tratamiento combinado a nivel metabolómico y transcriptómico, tratando de encontrar respuesta al incremento de eficacia observado en el tratamiento combinado. Los resultados obtenidos parecen indicar que el incremento de la toxicidad del tratamiento combinado estaría relacionado con cambios a nivel metabólico, debido en concreto a un incremento en el contenido de los derivados del quinato, y no debido a cambios de niveles de transcripción. Se realizó un perfil metabólico no dirigido para comparar el perfil metabólico de ambas poblaciones tratadas con glifosato y para determinar si otros cambios en el perfil metabólico podrían estar contribuyendo al incremento en la toxicidad del tratamiento combinado. Entre todos los compuestos del metabolismo primario y secundario evaluados, los derivados del quinato fueron los únicos compuestos que se acumularon en este tratamiento de manera diferencial, evidenciando su papel en el incremento de la toxicidad de este tratamiento. Por último, se evaluó el papel de los amino ácidos aromáticos y de algunos intermediarios metabólicos (siquimato, quinato, corismato y antranilato) en la regulación de la ruta del siquimato mediante incubación de discos de hojas con ellos. Se observó que los aminoácidos aromáticos, al ser aplicados en combinación con el herbicida, neutralizaron los efectos del glifosato a nivel transcipcional pero no la acumulación del siquimato. Ninguno de los intermediarios metabólicos evaluados mimetizó completamente el efecto del glifosato en la ruta del siquimato. Sin embargo, el siquimato fue el metabolito que indujo una sobreexpresión de la mayoría de los genes de la ruta del siquimato, de una manera similar al herbicida. Estos resultados sugieren que la inducción en la transcripción observada tras el tratamiento con glifosato podría estar mediada, al menos en parte, por la acumulación de siquimato. Resumiendo, esta tesis aporta nuevos aspectos en la regulación de la ruta del siquimato tras la aplicación de glifosato, y aborda el efecto del tratamiento combinado del herbicida con quinato a nivel práctico y fisiológico, tratando de encontrar las causas de ese incremento en la toxicidad.

Glyphosate is the most widely used herbicide worldwide. The site of action of this herbicide is the inhibition of the 5‐enolpyruvylshikimate‐3‐phosphate synthase (EPSPS), a key enzyme in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, also known as shikimate pathway. One of the physiological processes triggered by the herbicide is quinate accumulation. Quinate is a secondary metabolite, formed in a lateral branch of the shikimate pathway. The detection of some physiological effects after applying quinate exogenously raised the possibility of using this compound in combination with glyphosate to enhance herbicide efficacy and to reduce the glyphosate doses in the control of Amaranthus palmeri. Glyphosate resistant populations have evolved in this species, and one of the most important resistance mechanism is EPSPS gene amplification, which leads to an overexpression of the enzyme target of glyphosate. The general objective of this work was to gain further insights in the regulation of the shikimate pathway after glyphosate treatment and the use of quinate as an enhancer of this herbicide in the control of glyphosate‐sensitive and resistant (due to gene amplification) A. palmeri plants. In this work, it was determined that applying quinate one day after glyphosate (combined treatment), become lethal a sub lethal glyphosate dose in the glyphosate‐sensitive population, laying the framework for the application of the both compounds to improve the efficacy of the herbicide and to reduce the doses in the control of the sensitive population. The higher toxicity of the combined treatment was related to an exacerbation of changes in the herbicide physiological markers previously reported (shikimate and free amino acid content). The pattern of the shikimate pathway after the combined treatment was approached at metabolic and transcriptional level, trying to explain the increase in the efficacy detected of the combined treatment in this population. The results obtained suggest that the enhancement of the toxicity observed after the combined treatment would be related mainly at metabolic level, due to the increase in the quinate derivative content, and not to changes at transcriptional level. A non‐targeted metabolic profiling was performed trying to compare the metabolic profile of both populations treated with glyphosate and to unravel if any change in the metabolomic profile of the plants treated with the combined treatment could contribute to the toxicity increase. Among all primary and secondary metabolites evaluated, the quinate derivatives were the only compounds that were accumulated differently after the combined treatment, evidencing their role in the increased toxicity of the combined treatment. Finally, the role of aromatic amino acids and the intermediates (shikimate, quinate, chorismate and anthranilate) in the regulation of shikimate pathway was evaluated by leaf disc incubation. It was observed that aromatic amino acids when applied combined with the herbicide abolished the glyphosate effects at transcriptional level but no shikimate accumulation. Also, none of the intermediates evaluated fully mimicked glyphosate effect on shikimate pathway. However, shikimate was the metabolite that induced the relative transcript level of most of the genes of the shikimate pathway, suggesting that the transcription induction detected after glyphosate treatment would be mediated, at least in part, by shikimate accumulation. In summary, this study describes new insights in the shikimate pathway regulation after glyphosate treatment and evaluates the combined treatment with quinate from a management and physiological points of view, trying to unravel the causes of its increase of the toxicity.