Puesta a punto de una técnica de identificación de variantes de la Kappa-caseína en la raza bovina frisona

Abstract

La kappa-caseína es una proteína láctea codificada por el gen CSN3, para el que se han descrito 14 polimorfismos. Concretamente, en la raza Frisona, las variantes de mayor interés debido a su frecuencia e influencia en las aptitudes tecnológicas de la leche son los alelos A, B y E. A tal efecto, especialmente en granjas que transforman derivados lácteos, es de interés la selección genética enfocada en el incremento de la frecuencia del alelo B, para el que se describen efectos favorables sobre las propiedades de coagulación y rendimiento quesero, y la disminución de los alelos A y E, asociados a efectos negativos. En el presente trabajo se ha realizado la puesta a punto de la técnica qPCR mediante sondas para la detección de los alelos A, B y E del gen CSN3 en la raza Frisona. Se diseñaron cebadores y sondas específicas TaqMan que permitiesen identificar las tres variantes en reacciones duplex. Bajo las concentraciones finales de 0,2 µM de cebadores y 0,4 µM de sonda, y tras ajustar los programas del termociclador; el límite de detección se fijó a 6,73x100 copias/µl, los rangos dinámicos definidos manifestaron valores de eficiencia cercanos al 100% y valores de CV (%) comprendidos entre 0,01 y 15,76, observando una buena repetibilidad del método. La aplicabilidad de la técnica reflejó buenos resultados en la discriminación de las variantes mediante las sondas de la posición 13104, pero el funcionamiento no tan óptimo de las sondas 13124, supuso la identificación imprecisa de algunos genotipos. Finalmente, se sugirió la posibilidad de rediseñar la sonda FAM_13124_G para lograr el perfeccionamiento de la técnica en futuros ensayos.

Kappa-casein is a milk protein encoded by the CSN3 gene, for which 14 polymorphisms have been described. Specifically, in the Friesian breed, the variants of greatest interest due to their frequency and influence on the technological aptitude of milk are the A, B and E alleles. Therefore, especially in farms that process dairy products, it is of interest genetic selection focused on increasing the frequency of the B allele, for which favourable effects on coagulation properties and cheese yield are described, and decreasing the A and E alleles, associated with negative effects. In the present work, the qPCR technique using probes for the detection of the A, B and E alleles of the CSN3 gene in the Friesian breed has been developed. Primers and specific TaqMan probes were designed to identify the three variants in duplex reactions. Under the final concentrations of 0,2 µM of primers and 0,4 µM of probe and after adjusting the thermo-cycling protocol, the detection limit was set at 6,73x100 copies/µl, the defined dynamic ranges showed efficiency values close to 100% and CV (%) values between 0,01 and 15,76, showing a good repeatability of the method. The applicability of the technique showed good results in the discrimination of variants using the 13104 probes, but the suboptimal performance of the 13124 probes led to imprecise identification of some genotypes. Finally, the possibility of redesigning the FAM_13124_G probe was suggested for further refinement of the technique in future assays.