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Genetic reductionist approach for studing the two-component signaling system in Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es una bacteria ubicua capaz de colonizar una gran variedad de ambientes. En el hombre, S. aureus coloniza las fosas nasales, piel de las axilas, ingles, garganta o incluso el tracto intestinal. Se calcula que un 20% de las personas adultas son portadores nasales de S. aureus. En determinadas circunstancias, la bacteria es capaz de atravesar la barrera epitelial y alcanzar los órganos internos. Cuando esto ocurre, S. aureus se convierte en un patógeno muy versátil capaz de causar enfermedades muy diversas, que pueden ir desde infecciones leves como forúnculos o abscesos hasta enfermedades graves como endocarditis, osteomielitis, neumonía o síndrome del shock tóxico. El desarrollo de S. aureus en distintos ambientes requiere que la bacteria sea capaz de sensar las condiciones ambientales, transmitir los estímulos al citoplasma y activar los cambios necesarios para adecuar la fisiología a dicho ambiente. El principal mecanismo para sensar y responder a las señales ambientales en bacterias son los sistemas de dos-componentes (TCSs). Los TCSs están formados por un sensor de membrana o histidinekinase (HK) y un regulador de respuesta citoplásmico (RR). En el proceso de activación, el sensor recibe su señal específica y se auto fosforila en un dominio histidina. A continuación el fosfato es transferido al residuo aspártico del RR que se encuentra en el citoplasma. De esta forma, el RR se activa y desencadena una respuesta que será acorde a la señal recibida. Normalmente, una bacteria posee varios TCSs, siendo su número proporcional al tamaño del genoma, al número de ambientes distintos en las que es capaz de crecer y a la complejidad de su diferenciación celular. Así, bacterias que viven en ambientes muy constantes, como las bacterias intracelulares estrictas carecen de TCSs, mientras que bacterias que viven en ambientes diversos pueden poseer cientos de ellos. En relación con el número y la función de los TCSs existen varias preguntas que hasta ahora no han sido analizadas: ¿cuántos TCSs necesita una bacteria de vida libre? ¿Son necesarios los TCSs cuando la bacteria crece en un ambiente constante? ¿Existe activación cruzada entre TCSs distintos in vivo? Para responder a estas preguntas y realizar un estudio global de los procesos celulares controlados por los TCSs, en esta tesis hemos realizado una aproximación genética reduccionista usando como modelo dos cepas genéticamente no relacionadas de S. aureus. El trabajo ha consistido en la deleción completa de los 15 TCSs no esenciales que posee S. aureus y la mutación del sensor (WalK) del TCS walKR, cuya deleción completa resulta letal. Las bacterias resultantes carecen del sistema sensorial y su obtención demuestra que en condiciones ambientales constantes estos sistemas son dispensables para la vida de S. aureus. Los mutantes deficientes en los TCSs muestran niveles de crecimiento indistinguibles a los de la cepa salvaje a 37ºC y 44ºC y un patrón metabólico similar. En cambio, los mutantes tienen deficiencias en el crecimiento a 28ºC, pierden la capacidad de reducción de nitratos, muestran mayor sensibilidad al Tritón X-100 así como una menor capacidad para sobrevivir en el ambiente e invadir células. Así mismo, los mutantes tienen reducida su virulencia y capacidad de colonizar órganos en un modelo de infección de ratón. Todos los fenotipos del mutante deficiente en los TCSs podían ser restaurados por la expresión ectópica de un único TCS indicando que cada uno de los fenotipos depende de un único TCS. Finalmente, la cepa deficiente en los TCSs ha sido utilizada como una plataforma para el estudio de la especificidad de transmisión de señal in vivo, un concepto que en inglés se denomina ‘cross-talk’ y que hasta ahora había sido estudiada in vitro. Para ello, hemos establecido una sencilla metodología que consiste en la complementación del mutante deficiente en TCSs con una colección de plásmidos que contienen una combinación de la familia de HKs y un RR. El análisis de las cepas complementadas nos ha permitido identificar la existencia de activación cruzada entre GraS y ArlR. Esta activación cruzada tiene lugar incluso en presencia de sus correspondientes parejas, la HK ArlS y el RR GraR. Teniendo en cuenta que durante este análisis global sólo hemos detectado activación cruzada entre estos TCSs, la conclusión de nuestro estudio es que la activación cruzada entre los TCSs puede ocurrir in vivo, pero no es frecuente. En el futuro las cepas deficientes en los TCSs, o cepas derivadas conteniendo únicamente uno de ellos, servirán para identificar el regulón que controla cada TCS o para identificar nuevos fármacos que bloqueen específicamente a los TCSs.

Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium adapted to live in a wide variety of environmental niches. In humans, S. aureus colonizes the nose, skin, axilla, groin, throat or intestinal tract. Approximately 20% of the anterior nares of healthy human adults are persistently colonized with S. aureus. In some circumstances, the bacterium is able to traverse the epithelial barrier reaching internal organs. When this occurs, S. aureus can cause a variety of diseases, ranging from minor skin infections, such as furuncles or abscesses, to severe infections, such as endocarditis, osteomyelitis, pneumonia or toxic shock syndrome. S. aureus needs to recognize environmental signals, transmit stimuli to the cytoplasm and activate the necessary changes to adapt the bacterial physiology to the conditions of each environmental niche. The main mechanism to sense and respond to environmental signals in bacteria is the two-component transduction system (TCSs). TCSs comprise a membrane sensor histidine kinase (HK) and a cytoplasmic response regulator (RR). During the activation process, the sensor receives a specific signal and autophosphorylates itself on a conserved histidine residue. The phosphate is then transferred to an aspartate residue of the cytoplasmic cognate RR. The phosphorylated RR triggers a specific response in accordance with the signal. The genome of a single bacterial species usually encodes for multiple signal transducers: the number often proportional to the genome size, the diversity of environments in which organisms live and the complexity in cellular differentiation. Bacteria inhabiting relatively stable host environments, such as obligate intracellular parasites, encode for few or even no TCS signalling systems, while ubiquitous bacteria that are able to live in a variety of environments encode high numbers of TCSs. In relation with the number and the function of TCSs in bacteria, several questions remain open: How many TCSs does a free-living bacterium need to live? Are TCSs necessary when bacteria live in a constant environment? Does cross-activation between different TCSs exist in vivo? With the aim to answer these questions and to carry out a global analysis of the cellular processes controlled by TCSs, we generated S. aureus mutants devoid of the TCS signalling networks by using a genetic reductionist approach on two genetically unrelated S. aureus strains. The work consisted in the sequential deletion of the 15 non-essential TCSs of S. aureus as well as the deletion of the sensor (WalK) of the walKR TCS, whose complete deletion is lethal. The resulting mutants lacking the TCSs demonstrate that under constant environmental conditions these systems are dispensable for S. aureus survival. Phenotypic analyses of the mutants devoid of TCSs revealed growth levels indistinguishable from the wild type at 37 and 44ºC, and similar metabolic capacities. However, mutants devoid of TCSs lose the capacity to reduce nitrate to nitrite, show lower growth rates at 28ºC and capacity to survive in the environment and higher sensitivity to detergents. Moreover, in the absence of TCSs, S. aureus is unable to invade eukaryotic cells and colonize organs, rendering the bacteria avirulent in a mouse infection model. Phenotypes associated to the TCS-deficient mutant can be restored by the ectopic expression of single TCSs, indicating that each phenotype is most likely modulated by a single TCS. The TCS-deficient strain was then used as a platform for studying signal transduction specificity (cross-talk) in vivo. For that purpose, we developed a simple method based on the complementation of the TCSdeficient mutant with plasmids that containing a combination of the HK family and a RR. Analysis of these complemented strains allowed the identification of cross-talk between GraS and ArlR. The cross-talk occurs even in the presence of the corresponding ArlS HK and GraR RR. Taking into account that our systematic analysis only found cross-activation between these two TCSs, we conclude that cross-activation between TCSs can occur in vivo, but it is rare. We anticipate that the strains lacking the TCSs, or the set of strains containing single TCSs, will be extremely useful to identify the regulon of each TCS or for finding antimicrobials that specifically block TCS functions.