New functions for Cyt proteins and sporulation determinants in Bacillus thuringiensis

Abstract

En este estudio, primero nos centramos a encontrar nuevas proteínas insecticidas y factores sinérgicos con actividad contra larvas de A. albopictus. Nuestro primer objetivo, fue caracterizar la actividad individual de las proteínas del cristal Cyt1Aa, Cry4Aa, Cry4Ba y Cry11Aa contra A. albopictus y encontrar nuevas proteínas que contribuyesen a diversificar los ingredientes activos basados en Bt actualmente disponibles. Uno de nuestros resultados nos permitió encontrar y caracterizar una nueva proteína Cyt1A-like, que aumentaba la actividad de Cry11Aa más de 10 veces y activaba a tres proteínas nuevas Cry53-like, Cry56Alike y Tpp36-like que no eran tóxicas por sí solas. Estos resultados posicionaron a las proteínas Cyt como facilitadores de la actividad de proteínas cristalinas que, de otro modo, no resultaban tóxicas. Como segundo objetivo, nos centramos en comprender el vínculo entre la esporulación y la formación de cristales en Bt. En la literatura, se describe extensamente cómo se acoplan ambos procesos están estrechamente relacionados. Sin embargo, la mayoría de dichos estudios suelen girar en torno a reguladores generales de la esporulación que, además, son críticos para la expresión de proteínas cristalinas. En este caso, nuestro objetivo fue encontrar determinantes de esporulación que fueran críticos para la generación de las esporas, pero prescindibles para la formación de los cristales. A través de una estrategia de mutagénesis aleatoria, descubrimos un gen esencial para la esporulación, spoIIIAA, que no afectaba a la producción del cristal. El transcriptoma del mutante spoIIIAA reveló que varios genes de la esporulación, así como una hidrolasa de la pared celular se encontraban afectados en su expresión. Además, varios factores de virulencia se encontraron sobre expresados, sin embargo, los genes de la proteína cristalina mantuvieron sus niveles de expresión sin cambios. Finalmente, reproducimos la misma mutación, mediante mutagénesis dirigida, en la cepa AM 65-52. Tanto la cepa parental como el mutante asporígeno derivado conservaron la capacidad de producir cristales activos contra las larvas de Aedes aegypti y A. albopictus. En resumen, en este trabajo proporcionamos nuevos conocimientos sobre las proteínas del cristal con actividad frente a mosquitos, especialmente las proteínas Cyt y su capacidad para habilitar la actividad de proteínas que, de otro modo, no serían tóxicas. Análogamente, se presentan resultados que posicionan a SpoIIIAA como un regulador crítico de la esporulación que no afecta a la expresión de las proteínas cristalinas.

In this study, we first aimed at finding new insecticidal proteins and synergistic factors with activity against A. albopictus larvae. Our first goal was to characterize the individual activity of Cyt1Aa, Cry4Aa, Cry4Ba and Cry11Aa against A. albopictus and find new proteins that contribute to diversifying the currently available Bt active ingredients. Interestingly, we found a new protein, Cyt1A-like, which increased the activity of Cry11Aa more than 10-fold and enabled the activity of three new Bt toxins, Cry53-like, Cry56A-like and Tpp36-like that were non-toxic on their own. These results positioned Cyt proteins, as enablers of activity for otherwise non-active crystal proteins in addition to their previously described synergistic properties. As a second objective, we focused on understanding the link between sporulation and crystal formation in Bt. In the literature, there is extensive data describing how sporulation and crystal formation are coupled. However, most of said studies usually revolve around master regulators of sporulation that are critical for the expression of crystal proteins. Here, we aimed at finding sporulation determinants that were critical for the generation of the spores but dispensable for crystal formation. Through randomized mutagenesis, we discovered an essential gene for sporulation, spoIIIAA, which did not affect the production of the crystal when interrupted. The transcriptome of the spoIIIAA mutant revealed that several sporulation genes were downregulated alongside a cell wall hydrolase. Moreover, several virulence factors were upregulated, however, the crystal protein genes had their expression levels unchanged. Finally, we reproduced the same mutation, through site directed mutagenesis, in the AM 65-52 strain. Both wild type strain and asporogenous derivative mutant retained the ability to produce crystals that were active against A. aegypti and A. albopictuslarvae. All in all, we provide novel insights into mosquitocidal crystal proteins, especially Cyt proteins and their ability to enable the activity of otherwise non-toxic proteins, and the importance of SpoIIIAA as a sporulation-specific regulator that does not affect the expression of crystal proteins.