En este trabajo se exponen los resultados obtenidos en el desarrollo de un
protocolo de transformación de la microalga Neochloris oleoabundans
(Chlorophyceae) empleando Agrobacterium tumefaciens.
Para la transformación se empleó el plásmido binario pGJ2798, portador del
gen de selección nptII, que confiere resistencia a antibióticos aminoglicosilados y el
gen informador gfp que codifica la p ...
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En este trabajo se exponen los resultados obtenidos en el desarrollo de un
protocolo de transformación de la microalga Neochloris oleoabundans
(Chlorophyceae) empleando Agrobacterium tumefaciens.
Para la transformación se empleó el plásmido binario pGJ2798, portador del
gen de selección nptII, que confiere resistencia a antibióticos aminoglicosilados y el
gen informador gfp que codifica la proteína GFP (green fluorescent protein).
Para el desarrollo del protocolo se realizaron experimentos sucesivos en los
que se evaluó el efecto de diferentes factores potencialmente implicados en el éxito
de la transformación, como son el periodo de cocultivo (24, 48 y 72 horas), la
temperatura (22 y 25ºC), la irradiación (oscuridad / fotoperiodo de 16 horas) durante
el periodo de cocultivo, y el tipo de soporte empleado durante la infección. Por otro
lado, y con el fin de aumentar la virulencia de A.tumefaciens se emplearon dos
concentraciones de acetosirigona en el cultivo bacteriano.
Los resultados mostraron que la irradiación durante el periodo de cocultivo es
un factor determinante para el éxito de la infección, obteniéndose una eficiencia de
30 colonias por millón de células sembradas, de las cuales un 82% mantiene el
fenotipo de resistencia al antibiótico de selección durante al menos un año.
La verificación molecular de transformantes mediante PCR permitió amplificar dos
fragmentos de 654 y 524 pares de bases correspondientes a los genes nptII y gfp
confirmando el carácter transgénico de las colonias obtenidas. No obstante, no se
pudo detectar la proteína GFP en las colonias transformadas. [--]
This work presents the results obtained in the development of a
transformation protocol for the microalgae Neochloris oleoabundans
(Chlorophyceae) using Agrobacterium tumefaciens.
The binary vector pGJ2798 harbouring a nptII selection gene, which confers
resistance to aminoglycoside antibiotics, and a gfp reporter gene that encodes the
GFP protein (green fluorescent protein), was used for tr ...
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This work presents the results obtained in the development of a
transformation protocol for the microalgae Neochloris oleoabundans
(Chlorophyceae) using Agrobacterium tumefaciens.
The binary vector pGJ2798 harbouring a nptII selection gene, which confers
resistance to aminoglycoside antibiotics, and a gfp reporter gene that encodes the
GFP protein (green fluorescent protein), was used for transformation.
In order to develop the transformation protocol, on one hand successive
experiments were conducted in which we evaluated the effect of different factors
potentially involved in successful transformation, such as co-culture period (24, 48
and 72 hours), temperature (22 and 25 ºC) , irradiation (darkness / photoperiod of 16
hours) during co-culture period , and medium used during infection. On the other
hand, to increase the virulence of A. tumefaciens, acetosyringone was added to the
bacterial culture at two final concentrations.
Results showed that irradiation during co-culture is a determining factor for
successful infection, yielding an efficiency of 30 colonies per million cells seeded, of
which 82% maintained their resistance to the antibiotic of choice for at least one
year.
PCR was used to successfully amplify fragments of the nptII (654bp) and gfp
(524 bp) genes from genomic DNA of transformed cells, confirming the transgenic
nature of these colonies. However, no GFP protein was detected in transformed
colonies. [--]
