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Transformación genética de Neochloris oleoabundans S. chantanchat & H.C. Bold (clorofita) mediada por Agrobacterium tumefaciens

En este trabajo se exponen los resultados obtenidos en el desarrollo de un protocolo de transformación de la microalga Neochloris oleoabundans (Chlorophyceae) empleando Agrobacterium tumefaciens. Para la transformación se empleó el plásmido binario pGJ2798, portador del gen de selección nptII, que confiere resistencia a antibióticos aminoglicosilados y el gen informador gfp que codifica la proteína GFP (green fluorescent protein). Para el desarrollo del protocolo se realizaron experimentos sucesivos en los que se evaluó el efecto de diferentes factores potencialmente implicados en el éxito de la transformación, como son el periodo de cocultivo (24, 48 y 72 horas), la temperatura (22 y 25ºC), la irradiación (oscuridad / fotoperiodo de 16 horas) durante el periodo de cocultivo, y el tipo de soporte empleado durante la infección. Por otro lado, y con el fin de aumentar la virulencia de A.tumefaciens se emplearon dos concentraciones de acetosirigona en el cultivo bacteriano. Los resultados mostraron que la irradiación durante el periodo de cocultivo es un factor determinante para el éxito de la infección, obteniéndose una eficiencia de 30 colonias por millón de células sembradas, de las cuales un 82% mantiene el fenotipo de resistencia al antibiótico de selección durante al menos un año. La verificación molecular de transformantes mediante PCR permitió amplificar dos fragmentos de 654 y 524 pares de bases correspondientes a los genes nptII y gfp confirmando el carácter transgénico de las colonias obtenidas. No obstante, no se pudo detectar la proteína GFP en las colonias transformadas.

This work presents the results obtained in the development of a transformation protocol for the microalgae Neochloris oleoabundans (Chlorophyceae) using Agrobacterium tumefaciens. The binary vector pGJ2798 harbouring a nptII selection gene, which confers resistance to aminoglycoside antibiotics, and a gfp reporter gene that encodes the GFP protein (green fluorescent protein), was used for transformation. In order to develop the transformation protocol, on one hand successive experiments were conducted in which we evaluated the effect of different factors potentially involved in successful transformation, such as co-culture period (24, 48 and 72 hours), temperature (22 and 25 ºC) , irradiation (darkness / photoperiod of 16 hours) during co-culture period , and medium used during infection. On the other hand, to increase the virulence of A. tumefaciens, acetosyringone was added to the bacterial culture at two final concentrations. Results showed that irradiation during co-culture is a determining factor for successful infection, yielding an efficiency of 30 colonies per million cells seeded, of which 82% maintained their resistance to the antibiotic of choice for at least one year. PCR was used to successfully amplify fragments of the nptII (654bp) and gfp (524 bp) genes from genomic DNA of transformed cells, confirming the transgenic nature of these colonies. However, no GFP protein was detected in transformed colonies.