Desarrollo de un método rápido basado en la PCR a tiempo real para recuento de Escherichia coli en leche cruda

Abstract

El hábitat natural de Escherichia coli es el tracto intestinal de humanos y animales y su presencia en un alimento indica generalmente una contaminación de origen fecal. Esta bacteria es un microorganismo marcador clásico de calidad higiénica y presencia de patógenos productos lácteos o el agua. Para la industria agroalimentaria es de interés desarrollar métodos rápidos, seguros y económicos para la detección de microorganismos marcadores como E. coli. La utilización de metodologías basadas en el análisis del ADN empleando la PCR a tiempo real (qPCR) permite en pocas horas realizar el recuento de microorganismos con alta sensibilidad y especificidad. El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar una técnica de qPCR con sonda TaqMan para el recuento de E. coli en leche cruda. Se diseñaron cebadores para amplificar un fragmento del gen uidA, presente en el 97% de las cepas de E. coli. Se optimizó la qPCR para el recuento de E. coli en cultivo puro (curvas de calibración celular) y se evaluó la técnica en muestras de leche inoculadas experimentalmente (curva de calibración en leche). El límite de cuantificación alcanzado fue de 7,3 x 102 u.f.c/mL, lo que se corresponde con 108 copias del genoma de E. coli en la reacción de qPCR, que mostró valores de eficiencia cercanos al 100% y un valor de Ct de 31,38 ± 0,01. Además, los valores del coeficiente de variación obtenidos en los estudios de repetibilidad (0,91%) y reproducibilidad (0,74%) del método fueron bajos, lo que demuestra la adecuada precisión del método.

The principal habitat of Escherichia coli is the intestinal tract of humans and animals and it is typically spread by fecal-contaminated food or drinking water. E. coli is a classical indicator bacteria for hygienic quality and the possible presence of pathogens in dairy products and water. For food industry, it is of interest to develop fast, safe and economical methods for the detection of indicator bacteria such as E. coli. In that respect, the use of methodologies based on DNA analysis using the real time PCR (qPCR) allows an enumeration of microorganisms in few hours with high sensibility and specificity. The objective of the present study was to develop a DNA-based method for enumeration of E. coli in raw milk. For this purpose, the primers were designed to amplify a fragment of uidA gene, which is present in 97% of E. coli strains. Optimization of qPCR method for E. coli enumeration in pure culture was done (cellular calibration curve) and it was evaluated in milk samples experimentally inoculated with E. coli (milk calibration curve). The results showed that the limit of quantification was 7.3 x 102 c. f. u/mL, which was comparable to 108 copies of E. coli genome in qPCR reaction. The reaction efficiency was close to 100% and the Ct values were 31.38 ± 0.01. Moreover, the coefficient of variation of Ct values obtained by qPCR were low, being 0.91% on the same day (repeatability) and 0.74% on different days (reproducibility), indicating that the method developed is precise.