RMN: aplicaciones en procesos de reconocimiento molecular y análisis conformacional

Abstract

Esta memoria de Trabajo de Fin de Máster consta de dos partes bien diferenciadas, que se corresponden con los dos trabajos de investigación llevados a cabo en el laboratorio de Chemical Glycobiology de CIC bioGUNE. Ambos proyectos tienen en común el empleo de la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) para obtener información, a nivel estructural atómico, de diferentes sistemas químicos de relevancia biológica. Proyecto 1. La química combinatoria dinámica dirigida por una proteína (Protein-directed dynamic combinatorial Chemistry, P-D DCC) es una herramienta poderosa para la identificación de ligandos que actúen sobre proteínas farmacológicamente relevantes. El potencial de esta técnica reside en la síntesis y selección in-situ de un determinado ligando, en presencia de una proteína objetivo. Así, múltiples fragmentos químicos reaccionan entre sí de forma reversible en presencia de la proteína, generando una librería de potenciales ligandos. El fenómeno de reconocimiento molecular en estas condiciones está bajo control termodinámico, de tal manera que el equilibrio químico resultante estará desplazado hacia el ligando que forme un complejo ligando-proteína más estable. De esta manera, la composición de la librería se desplaza hacia el/los ligando/s de mayor afinidad por la proteína a expensas de otros. Tras alcanzar el equilibrio, el análisis correspondiente, revelará estos ligandos con mayor afinidad, ya que mostrarán unas señales amplificadas en comparación con aquellos ligandos de menor afinidad. Nuestros colaboradores del Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas (CSIC) en Madrid, dirigido por la Dra. Ruth Pérez-Fernández, aplicaron esta metodología para la identificación de acilhidrazonas como ligandos de la enzima lisozima de la clara de huevo (HEWL), a partir de una librería de fragmentos compuesta por 4-formil-3-metoxibenzonitrilo y una serie de hidrazidas. Los resultados del grupo de la Dra. Pérez-Fernández, mostraron la clara amplificación de una de las acilhidrazonas en presencia de la lisozima. Estos resultados han dado pie al primero de los trabajos de investigación que se presenta en esta memoria, cuyo objetivo ha sido la determinación de las bases estructurales de la amplificación de la citada acilhidrazona en presencia de lisozima. Para ello, se llevó a cabo un estudio de reconocimiento molecular basado en la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) entre la lisozima y diferentes componentes de la librería dinámica combinatoria. Primeramente, se asignaron los espectros RMN de la proteína objetivo, para posteriormente estudiar la perturbación del desplazamiento químico en presencia de diferentes elementos de la librería. Además, se usó la estrategia de Diferencia de Transferencia de Saturación (Saturation Transfer Difference, STDNMR), que permite caracterizar el fenómeno de reconocimiento molecular también desde el punto de vista del ligando. La información obtenida de estos experimentos, en combinación con procedimientos de docking molecular, permitió proponer la estructura tridimensional del complejo Lisozima-acilhidrazona, y deducir así las bases estructurales de la selección molecular. Proyecto 2. Staphylococcus aureus es una bacteria Grampositiva, asociada con una gran variedad de infecciones que pueden derivar en diferentes enfermedades como artritis séptica y neumonía. La pared celular de S. Aureus está cubierta por polisacáridos capsulares (CP), que están unidos covalentemente al peptidoglicano. Los CPs representan la primera línea de defensa para la bacteria. Uno de los CPs más abundante de S. Aureus es CP8, cuya unidad de repetición es el trisacárido →3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-α-D-FucNAc- (1→. Las funciones biológicas de los glicanos están íntimamente relacionadas con su estructura y conformación. Así, en este segundo proyecto de investigación, se llevó a cabo el análisis conformacional de dos oligosacáridos de CP8 con una y tres unidades de repetición (es decir un trisacárido y un nonasacárido). Estos oligosacáridos han sido obtenidos en forma pura mediante síntesis química en el laboratorio del Prof. Dr. Jeroen Codee de la Universidad de Leiden. Para ello, se adquirieron diferentes experimentos de RMN a alto campo (800 MHz), que tras su análisis e integración con protocolos de modelado molecular permitieron deducir las preferencias conformacionales de estos oligosacáridos en disolución.

This master’s thesis report consists of two distinct parts, which correspond to the two research projects carried out in the CICbioGUNE Chemical Glycobiology laboratory. Both projects have in common the use of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to obtain information, at the atomic level, of different chemical systems of biological relevance. Project 1. Protein-directed dynamic combinatorial chemistry (P-D DCC) is a powerful tool for the identification of ligands that act on pharmacologically relevant proteins. The potential of this technique lies in the in-situ synthesis and selection of a certain ligand, in the presence of a target protein. Thus, multiple chemical fragments react with each other reversibly in the presence of the protein, generating a library of potential ligands. The molecular recognition process in this situation is under thermodynamic control, in such a way that the resulting chemical equilibrium will be shifted towards the product that forms the more stable ligandprotein complex. In this way, the composition of the library shifts towards the ligand(s) with the highest affinity for the protein at the expense of others. After reaching equilibrium, the corresponding analysis will reveal these ligands with higher affinity, since they will show amplified signals compared to those ligands with lower affinity. Our collaborators at the Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas (CSIC) in Madrid, directed by Dr. Ruth Pérez-Fernández, applied this methodology for the identification of acylhydrazones as ligands of the egg white lysozyme enzyme (HEWL), from a library of fragments composed of 4-Formyl3-methoxybenzonitrile and a series of hydrazides. The results of Dr. Pérez-Fernández's group showed the clear amplification of one of the acylhydrazones in the presence of lysozyme. These results have given rise to the first research project presented in this report, whose objective has been the determination of the structural bases of the amplification of the aforementioned acylhydrazone in the presence of lysozyme. For this, a molecular recognition study based on Nuclear Magnetic Resonance (NMR) was carried out between lysozyme and different components of the dynamic combinatorial library. First, the NMR spectra of the target protein were assigned to later study the perturbation of the chemical shift in the presence of different elements of the library. In addition, the Saturation Transfer Difference (STD-NMR) strategy was used, which allows characterizing the molecular recognition phenomenon also from the ligand point of view. The information obtained from these experiments, in combination with molecular docking procedures, allowed to propose the three-dimensional structure of the Lysozyme-acylhydrazone complex, and thus deduce the structural bases of molecular selection. Project 2. Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium, associated with a wide variety of infections that can lead to different diseases such as septic arthritis and pneumonia. The cell wall of S. aureus is covered by capsular polysaccharides (CP), which are covalently linked to peptidoglycan. CPs represent the first line of defense for the bacteria. One of the most abundant CPs of S. Aureus is CP8, whose repeating unit is the trisaccharide →3)-β-DManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3) -α-D-FucNAc-(1→. The biological functions of glycans are closely related to their structure and conformation. Thus, in this second research project, the conformational analysis of two CP8 oligosaccharides with one and three repeating units (i.e., a trisaccharide and a nonasaccharide) was carried out. These oligosaccharides have been obtained in pure form by chemical synthesis in the laboratory of Prof. Dr. Jeroen Codée of the University of Leiden. For this, different NMR experiments were acquired at high field (800 MHz), which after the corresponding analysis and integration with molecular modeling protocols, allowed us to deduce the conformational preferences of these oligosaccharides in solution.