Fabricación y caracterización de nanobiohíbridos: optimización de la interfaz entre nanoestructuras de oro y proteínas para posibles aplicaciones biosensoras

Abstract

En las últimas décadas, la investigación en el campo de los nanomateriales se ha desarrollado considerablemente, debido a las potenciales aplicaciones de estos materiales en muy diversos campos de la ciencia. En muchas de estas aplicaciones los nanomateriales se combinan con biomoléculas para formar nuevas estructuras híbridas. Estos nanobiohíbridos (NBH), presenta nuevas propiedades y funciones, pues de la combinación de ambos, el nanomaterial y las biomoléculas, origina respuestas totalmente diferentes, lo cual incrementa el rango de aplicaciones. Sin embargo, conseguir interfaces funcionales entre proteínas y superficies presenta grandes desafíos. La estructura y función de las proteínas están fuertemente influenciadas por el material, el tamaño, la forma y por la química superficial, que puede ser altamente variable. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos implicados en la interacción de sistemas biológicos con nanomateriales es de interés tanto en las disciplinas fundamentales como en las aplicadas. El contenido de esta tesis está principalmente enfocado en llevar a cabo una eficiente inmovilización de proteínas en nanoestructuras de oro (nanopartículas de oro y superficies nanoestructuradas periódicas de oro), de manera que una vez unido al nanomaterial, éstas conserven su configuración funcional, y así poder entender los mecanismos relacionados con la interacción entre proteínas y nanoestructuras de oro. Para ello, la tesis se ha dividido en dos grandes bloques. En el primero de ellos se ha descrito el desarrollo de métodos de biofuncionalización de nanopartículas de oro con enzimas. Así, se ha estudiado la biofuncionalización de nanopartículas de oro de 9,6 nm de diámetro con la superóxido dismutasa de hierro, y la glucosa oxidasa, con el objetivo de optimizar la actividad y estructura de las enzimas en las nanopartículas. Se ha explorado el comportamiento de las proteínas en función de la química superficial de la nanopartícula, del microambiente, del uso de aditivos proteicos estabilizadores, y del método de unión (adsorción física y unión covalente). Se ha conjugado la proteína recombinante superóxido-dismutasa de hierro (rVuFeSOD) de caupí (Vigna unguiculata) a Au NPs covalentemente y electrostáticamente, utilizando ácido mercaptoundecanóico como nexo de unión. Se ha determinado el efecto de la concentración del ligando en la cobertura y la actividad de la proteína, produciendo un efecto contrario dependiendo del método de unión. Así, se ha comprobado que en la adsorción física, la concentración de ligando tiene un efecto más pronunciado en la cobertura que en la actividad mientras que en la unión covalente tiene un efecto más negativo en la actividad, llegando a producir la desnaturalización de la proteína debido a un exceso de puntos de unión con la superficie. Para este particular sistema, la adsorción física ha resultado un mejor método de unión. Con el objetivo de profundizar más en la adsorción física, la glucosa oxidasa se ha conjugado a nanopartículas de oro. Esta vez se ha caracterizado tanto la cobertura, la actividad enzimática, así como la estructura secundaria de la proteína una vez inmovilizada en la superficie de la NP. Se ha comprobado que las interacciones con las nanopartículas de oro pueden alterar significativamente la estructura y la función de la glucosa oxidasa. Las nanopartículas, pueden mejorar la unión del sustrato, al tiempo que reducen la actividad catalítica, indicando que los efectos estéricos no son tan importantes como la propia desnaturalización. La modificación del microambiente de la proteína mediante la adición de NaCl y glucosa mejora la actividad y el plegamiento. La glucosa es capaz de estabilizar el plegado de la proteína, pero no da lugar a grandes mejoras en la actividad, y el NaCl mejora la actividad, pero no la estructura secundaria. Esto significa que al planificar la inmovilización, es necesario investigar tanto la estructura como la actividad de la enzima, ya que no siempre se correlacionan. El segundo bloque del trabajo se ha centrado en la inmovilización covalente de anticuerpos monoclonales anti-caseína a superficies periódicas de nanodiscos de oro, para la construcción de un inmunosensor óptico basado en el fenómeno de la resonancia del plasmón superficial localizado (LSPR). La biofuncionalización de la superficie sensora es un paso clave en el desarrollo de un inmunosensor, ya que determina la especificidad, sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad del mismo. Como paso previo a la biofuncionalización se ha realizado la caracterización de la respuesta óptica de obleas formadas por nanoestructuras de líneas y discos con un espectrofotómetro de laboratorio, siendo los nanodiscos 2,6 veces más sensibles al trabajar a una longitud de onda constante (6,7 Abs∙RIU-1). Para terminar, se ha desarrollado un protocolo de medida de caseína. El anticuerpo se ha unido covalentemente a la superficie a través de la química EDC/NHS. La optimización de proceso de inmovilización ha consistido en el estudio sistemático de parámetros tales como la composición de la SAM, diferentes soluciones tampón, la concentración de anticuerpo en la superficie, y el flujo de inmovilización. Asimismo se ha optimizado el proceso de unión antígeno-anticuerpo. Para ello se han estudiado el reconocimiento en función de la solución tampón, flujo de trabajo, solución de regeneración, y unión inespecífica. Se han reutilizado los chips durante más de 10 días llegando a realizar más de 40 ciclos de unión y regeneración con muy poca pérdida de señal, demostrando la robustez del método. Se ha obtenido un límite de detección de 0,5 μg∙mL-1 y un rango dinámico de 1-10 μg∙mL-1. La reproducibilidad del método queda probada por los bajos coeficientes de variación intra- e inter-ensayo.

The research on nanomaterials has experienced, in the past years, a growing interest due to their potential applications in different industrial sectors and, in particular, in the field of biomedicine. The combination of nanomaterials and biomolecules to form new hybrid structures called nanobiohybirids (NBH) is considered a new strategy adopted to reach completely new properties and functions, extending the range of application of such structures. However, achieving functional interfaces between proteins and surfaces is not straightforward and requires extensive optimization and validation to control the structure and function of proteins linked to the nanomaterials which are strongly influenced by its size, shape and surface chemistry. Therefore, the understanding of the mechanisms involved in the interaction of biological systems with nanomaterials is of great interest in both the fundamental and applied disciplines. The content of this thesis is mainly focused on the development of an efficient immobilization of proteins on gold nanostructures (gold nanoparticles and periodic nanostructured surfaces). Once the protein is attached to the nanomaterial, retains its functional configuration and, hence, the mechanisms related to the interaction between proteins and gold nanostructures can be elucidated. The thesis has been divided into two main parts: In the first one, the development of biofunctionalisation methods of gold nanoparticles with enzymes is described. The second one relates to the optimization of covalent immobilization of anti-casein monoclonal antibodies to periodic surfaces of gold nanodiscs, for the development of an optical immunosensor based on localized superficial plasmon resonance (LSPR).