Transformación genética de cebada con At-SSIV y análisis de su efecto en el metabolismo del almidón y biomasa

Abstract

El almidón es el principal carbohidrato de reserva en plantas. Este metabolito es empleado por la planta para su crecimiento y desarrollo durante la ausencia de luz. Este valioso polisacárido es acumulado en órganos heterotróficos, tales como semillas de cereales, raíces de cassava y tubérculos de patata. El almidón representa la fuente más importante de carbohidratos en la dieta humana y posee muchas aplicaciones tanto comerciales como industriales (Delcour et al., 2010). Se han llevado a cabo muchas investigaciones a través de la ingeniería genética con el fin de mejorar el rendimiento y calidad de almidón, respondiendo a la demanda del sector industrial. Estudios recientes han demostrado que la almidón sintasa clase IV (starch synthase class IV, SSIV) de Arabidopsis Thaliana está envuelta en la iniciación de gránulos de almidón en hojas ya que el doble mutante en los genes SSIII y SSIV mostró un menor contenido de almidón las mismas (Szydlowski et al., 2009). Más significativo resulta el hecho de que la sobreexpresión de At-SSIV en Arabidopsis induce la acumulación de almidón en hojas y aumenta el contenido de almidón en tubérculos de patata (Gámez-Arjona et al., 2011). Con el objeto de caracterizar el papel de SSIV en la producción de biomasa y almidón tanto en órganos autótrofos como en heterótrofos, se generarán líneas de cebada (Golden Promise c.v.) que sobre-expresan SSIV y SSIV fusionada a la proteína verde fluorescente (SSIV-GFP). La transformación genética de la cebada fue llevada a cabo siguiendo el método descrito por Hansel et al. (2004) mediante la cepa de Agrobacterium Tumefaciens AGL1, utilizando los vectores binarios, PBract214-AtSSIV y PBract214-AtSSIV-GFP. Primeramente se seleccionarán líneas transgénicas de cebada mediante germinación en medio selectivo y análisis por PCR. Seguidamente se realizarán análisis por western blot para comprobar la expresión de SSIV y SSIV-GFP. Por último, se cuantificará el contenido en almidón y la biomasa en semillas y hojas de las líneas transgénicas de cebada seleccionadas.

Starch is the main storage carbohydrate in plants which is used to sustain growth and development during absence of light, this valuable polysaccharide is accumulated in heterotrophic organs and many storage organs such as seeds of cereal crops, roots of cassava and potato tubers which represents the most important carbohydrate in human diet and has a number of commercial and industrial applications (Delcour et al., 2010). Many researches has been carried out using breeding and genetic engineering to improve yields, quality of starch and produce starch with novel feature in plant, including cereal grains (wheat, rice, corn, oats, barley as well as tubers such as potato) that fits industrial requirements. Recent studies have shown that Arabidopsis starch synthase class IV (SSIV) is involved in the initiation of starch granule in Arabidopsis leaves and Arabidopsis double mutant SSIII and SSIV display a decreased starch content in leaves (Szydlowski et al., 2009). Even more, the over expression of Arabidopsis SSIV induce the accumulation of starch in chloroplast leaves of Arabidopsis and leads to increased starch content in potato tubers (Gámez-Arjona et al., 2011). In this work we will produce barley lines (Golden promise c.v.) overexpressing SSIV and SSIV fused with green fluorescent protein (SSIV-GFP) using Agrobacterium tumefaciens AGL1 strain, with the aim to characterize the effect of SSIV on starch accumulation and biomass in both autotrophic and heterotrophic organs. First we will select transgenic barley lines by selective germination and using PCR analysis, followed by western blot analysis in order to achieve SSIV and SSIVGFP gene expression. Finally starch content and biomass in seeds and leaves from the different transgenic barley lines selected will be measured.