Tesis doctorales DPA - NES Doktoretza tesiak
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Browsing Tesis doctorales DPA - NES Doktoretza tesiak by Author "Caballero Murillo, Primitivo"
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Publication Open Access Biotechnological development of a new bioinsecticide based on a Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus from Spain(2015) Arrizubieta Celaya, Maite; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaEl taladro del tomate, Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), es una de las principales plagas polífagas de la Península Ibérica. El nucleopoliedrovirus simple de H. armigera (HearSNPV) es un método eficaz para el control de dicha especie. En esta tesis, se evaluó la diversidad genotípica de dos aislados españoles del HearSNPV con el objetivo de seleccionar una mezcla de genotipos con mejores características insecticidas. La caracterización biológica reveló que la mezcla co-ocluida de dos genotipos (HearSP1B:LB6), en proporción 1:1, presenta propiedades insecticidas mejoradas, por lo que fue seleccionada como materia activa de un nuevo bioinsecticida. Con el objetivo de detectar los cambios genéticos responsables de estas diferencias en el fenotipo, se realizó la secuenciación completa del genoma de 5 genotipos. Las mayores diferencias entre todos estos genotipos se localizan en las hrs y en los genes bro. Además, se identificaron mutaciones puntuales en genes implicados en la replicación del ADN, la transcripción viral, o genes estructurales, que podrían ser responsables de la reducida producción de OBs de los genotipos de HearSP1 o el aumento de la patogenicidad de HearSP1B. También, se identificaron diversas mutaciones localizadas en los genes iap-2, iap-3 y hoar que podrían estar relacionadas con la estrategia de transmisión o con la capacidad para establecer infecciones encubiertas en el insecto huésped. Con el objetivo de ampliar el espectro de huéspedes de HearSNPV se aplicó la tecnología de co-oclusión de baculovirus para obtener muestras de OBs en las que se encontrasen co-envueltos HearSNPV y HearMNPV, para obtener una mezcla con las características insecticidas deseables de HearSNPV y el amplio espectro de huéspedes de HearMNPV. Cuando larvas de H. armigera fueron infectadas primero con HearMNPV y 12 o 24 horas más tarde con HearSNPV, los genomas de ambos se co-ocluyeron en los OBs en la misma proporción (1:1). Sin embargo, la mezcla co-envuelta no presentó mejores características fenotípicas, pero aumentó el espectro de huéspedes de HearSNPV, ya que este virus fue capaz de entrar e infectar a especies no susceptibles como S. frugiperda y M. brassicae. Con el fin de optimizar las condiciones para la producción masiva del virus, se evaluó el efecto de varios factores sobre la producción de cuerpos de oclusión (OBs). Los resultados obtenidos mostraron que la mayor producción de OBs se consigue inoculando larvas L5 recién mudadas con la CL80, e incubando las larvas individualizadas a 30ºC. La eficacia y la persistencia en campo de un formulado sencillo del nuevo bioinsecticida se compararon con las de varios insecticidas comerciales en cultivos de tomate en invernadero y en campo abierto. Dicho formulado protegió al cultivo con una eficacia similar a la de los insecticidas comerciales Dursban®, Turex® y Spintor®. En cambio, su persistencia fue mayor que la de los insecticidas comerciales, aunque las diferencias fueron más notables en los cultivos de invernadero. Toda esta información ha sido objeto de una solicitud de patente (P201430956), y constituye la base para el desarrollo de un nuevo bioinsecticida. Este nuevo bioinsecticida es una herramienta muy útil para el establecimiento de una agricultura sostenible en los cultivos de tomate en la Península Ibérica, ya que puede ser incluido en programas de Manejo Integrado de Plagas.Publication Open Access Chrysodeixis chalcites nucleopolyhedrovirus: a useful component for IPM programs on the Canary Islands banana crops(2017) Fuentes Barrera, Ernesto Gabriel; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Hernández Suárez, Estrella; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaLa platanera (Musa acuminata Colla) es uno de los principales cultivos de las Islas Canarias, representando el 30% de la producción agrícola total del archipiealago. Dicho cultivo se realiza bajo invernaderos de malla principalmente en las vertientes cálidas del sur de las islas, y al aire libre en las frías vertientes del norte. Por ello, los cultivos bajo malla presentan mayores poblemas fitosanitaríos. Chrysodeixis chalcites (Esper, 1789) (Lepidoptera: Noctuidae) ha sufrido cambios importantes en su hábitos alimenticios. Actualmente se alimenta principalmente de los frutos de platanera, produciendo dafios en la epidermis que reducen claramente su valor comercial. El control de dicha plaga implica el uso repetido de un reducido número de materias activas, lo que favorece la aparición de resistencia, y por lo tanto disminuyendo su efectividad. Además, desde el año 2014 la gestión integrada de plagas (GIP) es de obligado cumplimiento en los sistemas de cultivo españoles. El objetivo de esta tesis ha sido abordar varios algunos aspectos importantes para la implementación de un programa de GIP efectivo en los cultivos de platanera de las Islas Canarias, España. La toma de decisiones efectiva en GIP se basa en la comprensión de las relaciones que se producen entre el número de individuos plaga, la respuesta de las plantas a los daños producidos por dichos individuos y las pérdidas económicas resultantes. Por ello, en la presente tesis se estimó en primer lugar la incidencia y el daño alimenticio producido por C. chalcites, así como las pérdidas de producción debidas al daño directo a la fruta y al coste indirecto derivado de la compra y aplicación de insecticidas. La prevalencia de infestaciones varió entre el 42 y 100% y fue similar en tos dos años de prospecciones. El daño foliar medio (1.5-7.3%) y el daño en fruta (1.0-5.7%) varió significativamente en las islas según el tipo de plantación (vertientes orientadas al norte o al sur) y estación. En general, los daños resultaron similares entre los dos tipos de plataciones, excepto en Gran Canaria y Tenerife, donde se registaron más daños foliares y en fruto, respectivamente , en la vertiente sur. Los daños también fueron similares entre las estaciones, Jo que indica que C. chalcites está presente en el cultivo durante todo el año. El peso de plátanos dañados respecto a la fruta cultivada varió significativamente entre las islas, desde el 0,2% en Tenerife hasta el 4,2% en El Hierro, siendo este daño especialmente importante en primavera. Dicho periodo es el más susceptible para determinar la cantidad y calidad de la fruta cosechada, ya que coincide con el desarrollo del fruto tras la floración. En total se perdieron unas 3.155 toneladas de platano/año, lo que representa el 1,5% de la producción anual (2,68 millones de euros/afio). Además, los costes de control con indoxacarb, el insecticida más utilizado (73%), supondrían unos 240€/ha por ciclo de cultivo. Dado que su uso continuado probablemente favorezca el desarrollo de resistencia, se necesitan nuevos insecticidas para rotar con los pocos productos autorizados . Entre ellos el nucleopoliedrovirus de C. chalcites, ChchNPV (Género Alphabaculovirus, Baculoviridae) resulta ser un insecticida seguro, eficiente y sostenible. El siguiente objetivo fue evaluar el uso potencial de ChchNPV como un nuevo agente de control biológico en GTP. Para ello, primero se estimó Ja prevalencia y diversidad genética de las variantes de ChchNPV presentes en las poblaciones naturales de C. chalcites en Canarias y después se evaluó la eficacia insecticida del aislado más prevalente en comparación con dos insecticidas usados frecuentemente, indoxacarb y Bacillus thuringiensis (Bt), a pequeña escala en plantas jóvenes de platanera en condiciones de invernadero y aire libre. En general, la prevalencia de infección por ChchNPV fue del 2,3%, siendo de 0-13,8% en El Hierro, 0-5,6% en La Palma, 0-4,8% en Tenerife, 0-1% en La Gomera y 0% en Gran Canaria. En plantaciones bajo invernadero, la prevalencia de infección fue el doble (3%) que al aire libre (l,4%). ChchNPV-TF1 fue la variante más abundante (82%) y extendida, por lo que se seleccionó para los ensayos de campo. La aplicación 109 cuerpos de oclusión (OBs)/I de ChchNPV-TF1 redujo significativamente la densidad larvaria y el daño foliar en plantas jóvenes de platanera, al igual que los productos convencionales indoxacarb y Bt. Sin embargo, la mayor mortalidad producida por ChchNPV-TF1 en las larvas recolectadas a lo largo del tiempo sugiere que adquisición de una infección letal ocurre durante un periodo de tiempo más extendido, en comparación con el breve periodo que manifiestan las larvas tratadas con los insecticidas convencionales. Estos resultados indican una mayor persistencia de ChchNPV-TF1 en la p!anta de platanera. El último objetivo de este trabajo abordó la evaluación de la eficacia de ChchNPV-TF1 para proteger los frutos de platanera de los daños producidos por C. chalcites en invernaderos de malla en plantaciones comerciales, durante un ciclo de cultivo completo en comparación con el tratameitno convencional. En los ensayos de 2014, el daño foliar fue similar entre las dos estrategias de control en las tres islas, mientras que el daño en fruto en las parcelas tratadas con ChchNPV-TF1 fue sorprendentemente mayor en Tenerife, pero similar en Gran Canaria y La Palma. En Tenerife y Gran Canaria Ja mortalidad larvaria fue mayor en la parcela tratada con ChchNPV-TFl, mientras en La Palma la baja incidencia no permitió determinar la mortalidad larvaria. En un segundo ensayo en Tenerife en 2015 los tratamientos con virus se aplicaron varios meses antes del dasarrollo del fruto, y esta vez ChchNPV-TF1 proporcionó un control efectivo, similar al proporcionado por los insecticidas convencionales. En conclusión, este nuevo agente de control biológico resulta útil para ser incluido en la gestión integrada de C. chalcites en cultivos de platanera de Canarias. Los resultados de esta tesis forman parte de un trabajo más amplio que tiene como objetivo definir los umbrales de daño de C. chalcites en cultivos de platanera y el uso potencial de este nuevo insecticida biológico.Publication Open Access Development of a new bioinsecticide based on a Chrysodeixis chalcites nucleopolyhedrovirus from the Canary Islands(2014) Bernal Rodríguez, Alexandra; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaChrysodeixis chalcites (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga importante que causa valiosos daños económicos en los cultivos de platanera de las Islas Canarias. El control efectivo de esta plaga con insecticidas químicos requiere muchas aplicaciones, aumentando los costes de producción, lo que puede derivarse en riesgos ambientales graves, y la acumulación de residuos químicos que dificultan la comercialización del plátano. En estos casos, una de las alternativas más realistas para el control seguro y eficaz de la plaga la constituyen los bioinsecticidas basados en microorganismos entomopatógenos incluidos los baculovirus. En condiciones naturales las poblaciones de C. chalcites se ven afectadas por un Alphabaculovirus (Baculoviridae) llamado C. chalcites nucleopoliedrovirus (ChchSNPV). El objetivo de esta tesis doctoral ha consistido en abordar algunos de los desarrollos biotecnológicos necesarios para la obtención de un nuevo bioinsecticida basado en un ChchSNPV autóctono de las Islas Canarias. Una buena parte de los resultados de esta tesis forman parte del contenido de una solicitud de patente para el desarrollo de un nuevo bioinsecticida (P201330487). Este bioinsecticida, además de ser el agente de control biológico más efectivo para el control de esta plaga en la actualidad, es una herramienta muy útil para la implantación de programas de protección integrada de cultivos y el establecimiento de una agricultura sostenible.Publication Open Access Genetic baculovirus determinants for pathogenicity, virulence and transmission(2015) Serrano García, Amaya; Caballero Murillo, Primitivo; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaEsta tesis se centra en la caracterización biológica del baculovirus de Spodoptera exigua para mejorar nuestro conocimiento sobre el papel de la diversidad genotípica y sobre la implicación de genes individuales en patogenicidad, virulencia y transmisión. Avances en la tecnología de secuenciación de ADN y los más bajos costes de la misma han facilitado la identificación de genes virales que pueden jugar un papel importante en el proceso de infectividad del SeMNPV. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis profundizan nuestro conocimiento en la diversidad genética y genotípica de SeMNPV, y de los baculovirus en general, y puede ayudar en el futuro a la mejora de las estrategias de control biológico basadas en baculovirus.Publication Open Access Interference of iflavirus in SeMNPV as a biological control agent(2017) Carballo Palos, Arkaitz; Caballero Murillo, Primitivo; Murillo Pérez, Rosa; Williams, Trevor; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaLa rosquilla verde, Spodoptera exigua (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), es una especie polífaga ampliamente distribuida por todas las zonas templadas del mundo, incluyendo España, donde se ya ha establecido, causando grandes pérdidas económicas en cultivos hortícolas de invernadero. Como alternativa al control químico, el nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua (SeMNPV, Baculoviridae) se ha propuesto, por su especificidad y eficiencia, como una alternativa preferente para combatir las plagas de S. exigua en el ámbito de la producción integrada o biológica. La aplicación del virus en campo no solo mata a un elevado porcentaje de las larvas, sino que las que sobreviven al tratamiento adquieren una infección subletal que es transmitida a los individuos de las siguientes generaciones favoreciendo así el control mediante SeMNPV de estas poblaciones de S. exigua. Las infecciones encubiertas son un fenómeno muy habitual en las poblaciones naturales de insectos. De hecho, en las poblaciones de campo de S. exigua, se ha detectado un amplio complejo de virus mediante el uso de nuevas técnicas de secuenciación (Next-Generation Sequencing, NGS). Concretamente , en las poblaciones almerienses de S. exigua se han identificado dos nuevos virus de RNA de la familia ltlaviridae: iflavirus 1 (SelV-1) e iflavirus 2 (SelV-2). Ambos iflavirus se encuentran con relativa frecuencia produciendo infecciones mixtas con el SeMNPV . Aunque se sabe que estos virus no producen infecciones letales en los insectos, se desconoce los efectos que estas tienen sobre el insecto huésped y como interfieren sobre la capacidad insecticida del SeMNPV como agente de control biológico. El objetivo de esta tesis ha sido determinar algunos aspectos de las interacciones de los iflavirus SelV-1 y SelV-2, que infectan naturalmente a poblaciones de S. exigua, con el SeMNPV, que ha sido desarrollado como bioinsecticida para combatir las plagas causadas por S. exigua. En primer lugar, se estudió la prevalencia y abundancia de SelV-1 y SelV-2 en adultos de S. exigua de diferentes orígenes geográficos, para establecer su importancia en poblaciones naturales y experimentales de la plaga. Se determinó que ambos iflavirus infectaban de manera persistente a seis poblaciones de S. exigua de diversos orígenes establecidas en cautividad, aunque con variaciones en la abundancia relativa de ambos iflavirus según su procedencia. En estudios previos se había observado que las infecciones letales del SeMNPV en huéspedes infectados por SelV generaban OB (cuerpos de oclusión) con iflavirus asociados. Esta asociación mejora la estabilidad del iflavirus fuera del huésped y su transmisibilidad e infectividad. En cambio, las propiedades insecticidas de los OBs asociados a SelV se vieron reducidas. En concreto, se observó que la presencia de SelV disminuye la patogenicidad (CL50) de OBs de SeMNPV, aunque no hubo variaciones significativas en el tiempo letal del virus (TMM) o en la producción de 08 por larva en el momento de su muerte. En larvas coinfectadas con el SeMNPV y suspensiones de iflavirus enriquecidas en SelV-1, SelV-2 o una mezcla de ambos, se han estudiado aspectos como la patogenicídad, tiempo letal, producción de OBs tras la muerte de la larva y la prevalencia del SeMNPV en adultos supervivientes a la infección. La concentración letal media (CLso) del SeMNPV disminuyó en presencia de SelV, aunque el tiempo medio de mortalidad no resultó afectado. La producción de OBs fue significativamente inferior en los individuos coinfectados. En larvas de S. exigua del cuarto estadio coinfectadas con SeMNPV y SelV se observó una reducción del incremento de peso explicando así la diferencia de producción de OBs por larva. Por último, la prevalencia de SeMNPV no se vio modificada por una coinoculación con iflavirus, pero la carga viral del SeMNPV aumentaba con la presencia de SelV-2 con respecto al control y a SelV-1. Los OBs producidos en larvas de S. exigua coinfectadas por SeMNPV e iflavírus presentaban características físicas diferenciales que nos permitió separar dos subpoblaciones de OBs en función del número de SelV-1 asociados a los OBs. Estas dos subpoblaciones de OBs mostraban distinta densidad específica por lo que fueron separados en un gradiente de sacarosa. OBs con menor densidad específica presentaban un menor número medio de genomas por OB del SeMNPV debido a una mayor presencia de genomas de SelV-1.Aunque el número de ODVs por 08 no fue significativamente distinto en ambas subpoblaciones de OBs,sí se pudo demostrar que el número medio de nucleocápsidas por ODV fue menor en los OBs que llevaban asociados un mayor número de genomas de SelV-1. Este resultado está en consonancia con la baja infectividad que presentan los OBs asociados a iflavirus detectada anteriormente. Por último, y debido a la importancia de iflavirus en las poblaciones de S. exigua, se estudió como afectaba la infección por iflavirus a algunas de las características biológicas de S. exigua. Se comprobó que las infecciones del SelV-1 afectaron negativamente a la ganancia de peso de las larvas y pupa y la supervivencia del adulto, comparado con insectos no tratados. Sin embargo, la inoculación del SelV-2 no produjo variaciones en ninguno de los parámetros estudiados. El análisis de la evolución de la infección por SelV a lo largo del desarrollo larvario, de pupa y adulto del huésped reveló aumentos importantes en la carga del SelV-1, mientras que el SelV-2 se mantuvo siempre a niveles bajos (basales). Las larvas de S. exígua con infecciones persistentes por SelV-1, naturales o inducidas , presentaron una mayor susceptibilidad al SeMNPV. El valor de la CLso del SeMNPV para las larvas con infección persistente por SelV-1 fue más de 4 veces menor que las larvas libres de SelV-1, mientras que el TMM se redujo en 12 horas. A parte de estos efectos positivos, las infecciones persistentes de SelV-1 también pueden afectar negativamente a ciertas características del SeMNPV como son la capacidad insecticida de los OBs asociados a SelV y la transm isión horizontal del SeMNPV en el medio. La asociación de los iflavirus puede afectar a la seguridad del SeMNPV como agente de control biológico ya que estos iflavirus guardan una estrecha relación con otros virus de RNA patógenos para humanos (hepatitis, polio, etc.). Todo ello nos lleva a concluir que las infecciones de iflavirus en las poblaciones de S. exigua pueden ser un inconveniente para la bioseguridad y para la producción a gran escala de bioinsecticidas, que actualmente se basa en el uso de líneas de insectos vivos los cuales deberían estar libres de infecciones.Publication Open Access Regulation of multiple infection in alphabaculoviruses: critical factors that determine success(2014) Beperet Arive, Inés; Caballero Murillo, Primitivo; López Ferber, Miguel; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaThis thesis is focused in the ability of different baculovirus species to coinfect a particular host. I investigate whether the co-occlusion of different species is allowed and if it confers some advantage to the viruses, like the generation and maintenance of the viral heterogeneity in ecosystems where two or more virus species are present. Furthermore, as co-infection with different species implies sharing of host resources, we would like to explore the mechanisms (if any) regulating co-infection. Does a virus present in a given cell produce a signal that blocks other virus infection? Can this signal discriminate in function of the relatedness of the genomes? The existence of a temporal window that may allow coinfections and after which the organism becomes refractive to a second infection was analyzed, both in vivo and in vitro. This work also studies, in depth, the factors involved in the establishment of the block to infection by the second virus, such as temporal influences or cellular rearrangements. In a second part, the complete sequence of a Nicaraguan isolate of the SfMNPV is shown and compared with the sequences of this virus that had been previously published. In order to increase our understanding of the virus and its evolution and adaptation to its natural host, we studied the functionality of a unique gene present only in SfMNPV (sf32), some genes suggested to have a host-dependent function (sf68, sf95 and sf138) and a gene undergoing positive selection (sf122).Publication Open Access Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus: the basis for a biopesticide product in Colombia(2013) Barrera Cubillos, Gloria Patricia; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaSpodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga que puede causar pérdidas de hasta un 60% en las producciones de maíz en Colombia. Por lo tanto, hay una reconocida demanda para desarrollar métodos sostenibles de control contra esta plaga. El nucleopoliedrovirus múltiple de S. frugiperda (SfMNPV: Baculoviridae) es una prometedora alternativa al uso de insecticidas químicos. El objetivo del presente trabajo fue establecer las bases científicas para el desarrollo de un nuevo biopesticida a partir de un SfMNPV autóctono de Colombia. Este estudio constituye la base para el desarrollo tecnológico de un biopesticida a base del SfMNPV y se propone como un componente para los futuros diseños de programas de control integrado de plagas del maíz en Colombia.Publication Open Access Vertical transmission of the Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus and its application in biological control(2016) Virto Garayoa, Cristina; Caballero Murillo, Primitivo; Murillo Pérez, Rosa; Williams, Trevor; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate PublikoaLas infestaciones de larvas de Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) son muy frecuentes en los cultivos de pimiento de los invernaderos de Almería. En estudios previos, la caracterización molecular e identificación de los aislados del nucleopoliedrovirus múltiple de S. exigua (SeMNPV; Baculoviridae) con mayor potencial insecticida así como el desarrollo de otras tecnologías (producción masiva y formulación) permitieron la obtención de un bioinsecticida que es más efectivo que los plaguicidas químicos convencionales para combatir las plagas de S. exigua en las condiciones de dichos invernaderos. Las aplicaciones de formulados de baculovirus se han realizado principalmente utilizando la modalidad de suelta inundativa, en la cual sólo cabe esperar que ejerza un efecto de control el inóculo liberado. Sin embargo, tras la aplicación de un tratamiento con baculovirus, además de la mortalidad producida por el inóculo liberado, se producen otros efectos sobre las sucesivas generaciones del insecto cuya repercusión en la regulación de las plagas que causa han sido poco estudiados. En esta tesis, básicamente se han analizado y cuantificado algunas interacciones huésped-baculovirus y se aportan datos cualitativos y cuantitativos que pueden servir de base para definir una metodología intermedia entre las sueltas de tipo inundativo e inoculativo.