Tesis doctorales DPA - NES Doktoretza tesiak

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http://hdl.handle.net/2454/14780

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Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus: the basis for a biopesticide product in Colombia
(2013) Barrera Cubillos, Gloria Patricia; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga que puede causar pérdidas de hasta un 60% en las producciones de maíz en Colombia. Por lo tanto, hay una reconocida demanda para desarrollar métodos sostenibles de control contra esta plaga. El nucleopoliedrovirus múltiple de S. frugiperda (SfMNPV: Baculoviridae) es una prometedora alternativa al uso de insecticidas químicos. El objetivo del presente trabajo fue establecer las bases científicas para el desarrollo de un nuevo biopesticida a partir de un SfMNPV autóctono de Colombia. Este estudio constituye la base para el desarrollo tecnológico de un biopesticida a base del SfMNPV y se propone como un componente para los futuros diseños de programas de control integrado de plagas del maíz en Colombia.
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Advanced studies of yeast metabolism under winemaking conditions. Paving the way for a predictive model
(2014) Martínez Moreno, Rubén; González García, Ramón; Morales Calvo, Pilar; Quirós Asensio, Manuel; Pisabarro de Lucas, Gerardo; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
The main objective of this PhD project is to contribute to the development of a quantitative model of Saccharomyces cerevisiae metabolism in winemaking conditions. This model would allow to assess the effect of different environmental variables and of a particular starter yeast strain not only on fermentation kinetics but also on the production of relevant fermentation products (such as ethanol, glycerol, acetic acid, or some volatile compounds). This model would be useful in the improvement and control of the fermentation process, as well as in the definition of a rational use of enological additives and starter cultures, in order to ensure and improve wine quality.
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Influencia de la fertilización nitrogenada y la conservación post-cosecha sobre las proteínas del gluten la calidad harinopanadera del trigo blando
(2014) González Torralba, Jon; Arregui Odériz, Luis Miguel; Farrán Blanch, Inmaculada; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Las proteínas del gluten, compuestas por gliadinas y gluteninas, son las responsables de que la masa elaborada con harina de trigo posea unas propiedades viscoelásticas que la distinguen con respecto a la de otros cereales. A su vez, la fertilización nitrogenada, además de su relación con el rendimiento del cultivo, influye de manera fundamental en la síntesis y acumulación de estas proteínas en el endospermo del grano. El aporte de N por encima de la dosis óptima para el rendimiento en Triticum aestivum L. cv. Berdún incrementó la concentración de N en grano y harina, los contenidos de gliadinas y gluteninas, así como la extensibilidad (L) y la fuerza (W) de la masa. Los contenidos de gamma-gliadinas y de gluteninas (tanto de alto (HMW) como de bajo peso molecular (LMW)) fueron los que mejor estimaron L y W, respectivamente, independientemente de la campaña y otras condiciones de cultivo. El cultivo de trigo en regadío permite obtener altos rendimientos pero, sin embargo, puede suponer una reducción de la calidad harino-panadera debido al efecto de dilución de la proteína. A pesar de la aplicación de dosis altas de N, las pérdidas de N por lixiviación de nitratos fueron en todos los casos inferiores al 5% del N total disponible para la planta, debido a que la moderada lluvia invernal y el ajuste del riego a las necesidades del cultivo limitaron el volumen de drenaje. En general, la eficiencia del N tendió a empeorar al aplicar dosis muy altas, si bien se observaron variaciones entre años de cultivo relacionadas con el aporte de N por el propio suelo. Tomando las cuatro variedades del ensayo en conjunto, ni el contenido de gamma- gliadinas, que se había mostrado como un buen estimador inter-campaña en el caso de cv. Berdún, ni cualquiera de los otros tipos proteicos resultaron de utilidad para explicar el valor de L. Sin embargo, se consiguió mejorar dicha estimación a través de cálculos basados en el contenido de cada una de la tres subfracciones (gammaA, gammaB, gammaC) que componen las gamma-gliadinas. El contenido de HMW-gluteninas se comportó como un buen estimador de W, a pesar de las diferencias entre variedades en su composición alélica. Además, las omega- gliadinas mostraron también una buena correlación con W, que podría estar relacionada con la estrecha asociación entre los loci Gli-1 y Glu-3. Gracias a dicha correlación, las omega-gliadinas podrían tener utilidad como marcador en programas de mejora genética. Una composición particular de las gamma-gliadinas que sea especialmente favorecedora de las propiedades extensibles de la masa podría estar relacionada así mismo con valores bajos de W, aun cuando la composición alélica de las HMWgluteninas de dicha variedad presente a priori una gran aptitud para destacar por sus cualidades de fuerza. La humedad del grano de trigo varió durante su almacenamiento hasta alcanzar la humedad de equilibrio en función de la temperatura y humedad relativa de la atmósfera circundante. Condiciones simultáneas de alta temperatura (30ºC) y alta humedad relativa (75%) provocaron un importante descenso del peso específico del grano, así como de L, mientras que ocasionaron un aumento de la tenacidad (P) y W. Estos cambios en la calidad harino-panadera pueden estar relacionados con las reacciones de intercambio disulfuro-sulfhidrilo en los polímeros de gluteninas. Además, la actividad alfa-amilásica disminuyó bajo cualquier condición de almacenamiento, pero especialmente cuando el grano se mantuvo a una alta temperatura. Por otro lado, el grano almacenado durante varios meses en las condiciones habituales presentes en un clima mediterráneo no experimentó modificaciones de importancia en su calidad harinopanadera.
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Genetic reductionist approach for studing the two-component signaling system in Staphylococcus aureus
(2014) Villanueva San Martín, Maite; Lasa Uzcudun, Íñigo; Toledo Arana, Alejandro; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Staphylococcus aureus es una bacteria ubicua capaz de colonizar una gran variedad de ambientes. En el hombre, S. aureus coloniza las fosas nasales, piel de las axilas, ingles, garganta o incluso el tracto intestinal. Se calcula que un 20% de las personas adultas son portadores nasales de S. aureus. En determinadas circunstancias, la bacteria es capaz de atravesar la barrera epitelial y alcanzar los órganos internos. Cuando esto ocurre, S. aureus se convierte en un patógeno muy versátil capaz de causar enfermedades muy diversas, que pueden ir desde infecciones leves como forúnculos o abscesos hasta enfermedades graves como endocarditis, osteomielitis, neumonía o síndrome del shock tóxico. El desarrollo de S. aureus en distintos ambientes requiere que la bacteria sea capaz de sensar las condiciones ambientales, transmitir los estímulos al citoplasma y activar los cambios necesarios para adecuar la fisiología a dicho ambiente. El principal mecanismo para sensar y responder a las señales ambientales en bacterias son los sistemas de dos-componentes (TCSs). Los TCSs están formados por un sensor de membrana o histidinekinase (HK) y un regulador de respuesta citoplásmico (RR). En el proceso de activación, el sensor recibe su señal específica y se auto fosforila en un dominio histidina. A continuación el fosfato es transferido al residuo aspártico del RR que se encuentra en el citoplasma. De esta forma, el RR se activa y desencadena una respuesta que será acorde a la señal recibida. Normalmente, una bacteria posee varios TCSs, siendo su número proporcional al tamaño del genoma, al número de ambientes distintos en las que es capaz de crecer y a la complejidad de su diferenciación celular. Así, bacterias que viven en ambientes muy constantes, como las bacterias intracelulares estrictas carecen de TCSs, mientras que bacterias que viven en ambientes diversos pueden poseer cientos de ellos. En relación con el número y la función de los TCSs existen varias preguntas que hasta ahora no han sido analizadas: ¿cuántos TCSs necesita una bacteria de vida libre? ¿Son necesarios los TCSs cuando la bacteria crece en un ambiente constante? ¿Existe activación cruzada entre TCSs distintos in vivo? Para responder a estas preguntas y realizar un estudio global de los procesos celulares controlados por los TCSs, en esta tesis hemos realizado una aproximación genética reduccionista usando como modelo dos cepas genéticamente no relacionadas de S. aureus. El trabajo ha consistido en la deleción completa de los 15 TCSs no esenciales que posee S. aureus y la mutación del sensor (WalK) del TCS walKR, cuya deleción completa resulta letal. Las bacterias resultantes carecen del sistema sensorial y su obtención demuestra que en condiciones ambientales constantes estos sistemas son dispensables para la vida de S. aureus. Los mutantes deficientes en los TCSs muestran niveles de crecimiento indistinguibles a los de la cepa salvaje a 37ºC y 44ºC y un patrón metabólico similar. En cambio, los mutantes tienen deficiencias en el crecimiento a 28ºC, pierden la capacidad de reducción de nitratos, muestran mayor sensibilidad al Tritón X-100 así como una menor capacidad para sobrevivir en el ambiente e invadir células. Así mismo, los mutantes tienen reducida su virulencia y capacidad de colonizar órganos en un modelo de infección de ratón. Todos los fenotipos del mutante deficiente en los TCSs podían ser restaurados por la expresión ectópica de un único TCS indicando que cada uno de los fenotipos depende de un único TCS. Finalmente, la cepa deficiente en los TCSs ha sido utilizada como una plataforma para el estudio de la especificidad de transmisión de señal in vivo, un concepto que en inglés se denomina ‘cross-talk’ y que hasta ahora había sido estudiada in vitro. Para ello, hemos establecido una sencilla metodología que consiste en la complementación del mutante deficiente en TCSs con una colección de plásmidos que contienen una combinación de la familia de HKs y un RR. El análisis de las cepas complementadas nos ha permitido identificar la existencia de activación cruzada entre GraS y ArlR. Esta activación cruzada tiene lugar incluso en presencia de sus correspondientes parejas, la HK ArlS y el RR GraR. Teniendo en cuenta que durante este análisis global sólo hemos detectado activación cruzada entre estos TCSs, la conclusión de nuestro estudio es que la activación cruzada entre los TCSs puede ocurrir in vivo, pero no es frecuente. En el futuro las cepas deficientes en los TCSs, o cepas derivadas conteniendo únicamente uno de ellos, servirán para identificar el regulón que controla cada TCS o para identificar nuevos fármacos que bloqueen específicamente a los TCSs.
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Regulation of multiple infection in alphabaculoviruses: critical factors that determine success
(2014) Beperet Arive, Inés; Caballero Murillo, Primitivo; López Ferber, Miguel; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
This thesis is focused in the ability of different baculovirus species to coinfect a particular host. I investigate whether the co-occlusion of different species is allowed and if it confers some advantage to the viruses, like the generation and maintenance of the viral heterogeneity in ecosystems where two or more virus species are present. Furthermore, as co-infection with different species implies sharing of host resources, we would like to explore the mechanisms (if any) regulating co-infection. Does a virus present in a given cell produce a signal that blocks other virus infection? Can this signal discriminate in function of the relatedness of the genomes? The existence of a temporal window that may allow coinfections and after which the organism becomes refractive to a second infection was analyzed, both in vivo and in vitro. This work also studies, in depth, the factors involved in the establishment of the block to infection by the second virus, such as temporal influences or cellular rearrangements. In a second part, the complete sequence of a Nicaraguan isolate of the SfMNPV is shown and compared with the sequences of this virus that had been previously published. In order to increase our understanding of the virus and its evolution and adaptation to its natural host, we studied the functionality of a unique gene present only in SfMNPV (sf32), some genes suggested to have a host-dependent function (sf68, sf95 and sf138) and a gene undergoing positive selection (sf122).
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Post-transcriptional regulation mediated by 3’-UTRs in bacteria
(2014) Ruiz de los Mozos Aliaga, Igor; Toledo Arana, Alejandro; Lasa Uzcudun, Íñigo; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
The presence of regulatory elements in the 3’ untranslated region (3’-UTR) of eukaryotic mRNAs controlling RNA stability and translation efficiency is widely recognized. In contrast, the relevance of 3’-UTRs in bacterial mRNA functionality has been disregarded. Here, we report evidences showing that around one-third of the mapped mRNAs of the major human pathogen Staphylococcus aureus carry 3’-UTRs longer than 100-nt and thus, potential regulatory functions. We also found that most of the long 3’-UTR ends in a Rho-independent transcriptional terminator. Based on this information, it is possible to predict 3’-UTRs in any bacteria. Thus, we analysed 25 genomes and found that 3’-UTRs longer than 100-nt are broadly distributed in prokaryotes. To evaluate the role that 3’-UTRs may play in controlling mRNA expression, we selected the long 3’-UTR of icaR mRNA, which encodes the repressor of the main exopolysaccharidic compound of the S. aureus biofilm matrix. We showed that base pairing between the 3’-UTR and the Shine-Dalgarno (SD) region of icaR mRNA interferes with the translation initiation complex and generates a double-stranded substrate for RNase III. We also unveiled that the icaR 5’-UTR controls the 5’-3’-UTRs interaction in response to temperature. At environmental temperature (23ºC), a three way-helical junction structure, generated by pairing of internal sequences from 5’-UTR and ORF regions, impairs the 5’-3’-UTR interaction, causing the accumulation of IcaR repressor and the inhibition of biofilm development. In contrast, at the human body temperature (37ºC), this structural conformation opens allowing the interaction of the 5’- and 3’- UTRs that inhibited IcaR translation leading to biofilm production. Our findings provide a singular example of a new potential post-transcriptional regulatory mechanism to modulate bacterial gene expression in response to temperature shifts through the interaction of a 3’-UTR with the 5’-UTR of the same mRNA.
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Identification, characterization and evolutionary history of the Escherichia coli glycogen operon
(2014) Almagro Zabalza, Goizeder; Pozueta Romero, Javier; Baroja Fernández, Edurne; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Representing one of the major storage carbohydrate in many bacteria, glycogen is a branched homopolysaccharide of α-1,4-linked glucose subunits with α-1,6-linked glucose at the branching points that accumulates under conditions of limiting growth when an excess of carbon is available and other nutrients are deficient. The exact role of this polyglucan in bacteria is not as clear-cut as in animal and yeast cells, but some studies have linked glycogen to extended bacterial survival, symbiotic performance, colonization and virulence. It is widely accepted that genes involved in Escherichia coli and Salmonella enterica glycogen metabolism are clustered in two tandemly arranged operons: glgBX (encompassing the genes coding for glycogen branching (GlgB) and debranching (GlgX) enzymes), and glgCAP (encoding the GlgC and GlgA anabolic enzymes, as well as the catabolic glycogen phosphorylase (GlgP)). However, the data regarding regulatory aspects of the expression of glycogen genes in E. coli are contradictory, thus questioning the presence of two operons. To get inshight into the trascriptional organization of glycogen genes, in the first chapter of this work I characterized glg genes transcription using RT (reverse transcriptase)-PCR approach. This analysisW revealed that E. coli cells possess transcripts comprising the five glgBXCAP genes. glg::lacZY expression analyses in cells lacking the region immediately upstream of the glgB gene revealed an almost total abolishment of glgB, glgX and glgC expression and a reduced expression of glgA and glgP. Similar type of analyses showed that glgA and glgP expression was almost totally abolished in cells lacking glgA upstream sequences, including glgC, glgB and the asd-glgB intergenic region upstream of glgB. All the data indicate that the five glgBXCAP genes are transcribed in a single transcriptional unit under the control of promoter sequences upstream of glgB and that an alternative suboperonic promoter driving glgA and glgP expression is located within glgC. Using computer searches for putative bacterial promoters and 5¿ RACE (rapid amplification of cDNA ends) techniques I identified the -35 and -10 sequences of both promoters as well as the trasnscription start sites. Finally, I measured glg::lacZY expression on cells lacking the relA or phoP regulatory genes. These analyses indicated that both glgBXCAP operon and the suboperonic promoter form part of RelA and PhoP-PhoQ regulons. To gain insight into the origin and evolutionary history of E. coli glgBXCAP operon and of its constituent genes, in the second chapter of this work I carried out a detailed comparative analyses of presence, copy number and arrangement of glg genes in 265 gammaproteobacterial species. These analyses revealed the occurrence of large variations in glg homolog copy number and arrangements. Subsequently, I carried out a phylogenetic analysis of glg genes of selected Gammaproteobacteria and I also explored the phylogenetic relationships of gammaproteobacterial glg genes with those of representative species of the main bacterial groups. I found an important discrepancy between the evolution of glg genes and the order of organismal descent, inferred from 16S rRNA analysis, indicating that glg genes have undergone a complex evolutionary history in which horizontal gene transfer have played an important role. However, I detected a notable exception constituted by Enterobacteriales/Pasteurellales (E/P) glg genes which show a strict vertical inheritance. These analyses also revelaed that E/P glg genes are related with glg genes of phylogenetically distant betaproteobacterial species Varivorax paradoxus S110, Thiomonas intermedia K12, Lepthotrix cholodnii SP-6 and Thauera mz1t. The genomic context analysis indicated that the glgBXCAP arrangement is conserved in the E/P group and interestingly, that the above mentioned betaproteobacterial species possess glgBXCAP and/or gene clusters very similar to glgBXCAP. The overall data allowed me tracing the evolutionary origin of glgBXCAP operon in the last common ancestor of the E/P group and suggest a possible horizontal gene transfer event of the glgBXCAP cluster from the E/P group to Betaproteobacteria.
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Development of a new bioinsecticide based on a Chrysodeixis chalcites nucleopolyhedrovirus from the Canary Islands
(2014) Bernal Rodríguez, Alexandra; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Chrysodeixis chalcites (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga importante que causa valiosos daños económicos en los cultivos de platanera de las Islas Canarias. El control efectivo de esta plaga con insecticidas químicos requiere muchas aplicaciones, aumentando los costes de producción, lo que puede derivarse en riesgos ambientales graves, y la acumulación de residuos químicos que dificultan la comercialización del plátano. En estos casos, una de las alternativas más realistas para el control seguro y eficaz de la plaga la constituyen los bioinsecticidas basados en microorganismos entomopatógenos incluidos los baculovirus. En condiciones naturales las poblaciones de C. chalcites se ven afectadas por un Alphabaculovirus (Baculoviridae) llamado C. chalcites nucleopoliedrovirus (ChchSNPV). El objetivo de esta tesis doctoral ha consistido en abordar algunos de los desarrollos biotecnológicos necesarios para la obtención de un nuevo bioinsecticida basado en un ChchSNPV autóctono de las Islas Canarias. Una buena parte de los resultados de esta tesis forman parte del contenido de una solicitud de patente para el desarrollo de un nuevo bioinsecticida (P201330487). Este bioinsecticida, además de ser el agente de control biológico más efectivo para el control de esta plaga en la actualidad, es una herramienta muy útil para la implantación de programas de protección integrada de cultivos y el establecimiento de una agricultura sostenible.
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Genetic baculovirus determinants for pathogenicity, virulence and transmission
(2015) Serrano García, Amaya; Caballero Murillo, Primitivo; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Esta tesis se centra en la caracterización biológica del baculovirus de Spodoptera exigua para mejorar nuestro conocimiento sobre el papel de la diversidad genotípica y sobre la implicación de genes individuales en patogenicidad, virulencia y transmisión. Avances en la tecnología de secuenciación de ADN y los más bajos costes de la misma han facilitado la identificación de genes virales que pueden jugar un papel importante en el proceso de infectividad del SeMNPV. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis profundizan nuestro conocimiento en la diversidad genética y genotípica de SeMNPV, y de los baculovirus en general, y puede ayudar en el futuro a la mejora de las estrategias de control biológico basadas en baculovirus.
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Situación epidemiológica y sanitaria de la salmonelosis porcina en la C.F. de Navarra y contribución al conocimiento de la patogénesis
(2015) Sánchez Alarcón, Samanta Rita; Grilló Dolset, María Jesús; San Román Aberasturi, Beatriz; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua: IIQ14064.RI1
El objetivo general de esta tesis doctoral fue analizar la situación epidemiológica y sanitaria de las infecciones por Salmonella spp. en una población representativa del ganado porcino de cebo y en cerdas reproductoras de producción intensiva de la C.F. de Navarra, así como analizar en los mismos animales distintos aspectos de la infección con transcendencia epidemiológica. Como resultado, se observó una baja prevalencia de salmonelosis tanto en los cerdos de engorde como en las cerdas reproductoras de Navarra y tanto en MLN como en heces. Esto garantiza un estado sanitario satisfactorio para la obtención de productos alimenticios de buena calidad sanitaria, situando al sector porcino de la C.F. de Navarra en un nivel competitivo, tanto al nivel nacional como internacional. El ganado reproductor no se pudo relacionar como fuente de infección activa de Salmonella para los cerdos de engorde. La serología mostró muy escasa concordancia con la microbiología, tanto a nivel individual como de granja, lo que limita su utilidad práctica para el control de la salmonelosis, aún menor en las cerdas reproductoras. Además, sólo en una pequeña proporción (10,5%) de los cerdos de engorde analizados se pudo sospechar una posible relación entre la infección ganglionar y la excreción del patógeno en heces. En el último Capítulo, se demuestra la existencia de infecciones simultáneas por varias cepas de Salmonella, lo que puede plantear distintas cuestiones sobre la epidemiología y patogénesis/inmunogenicidad de las infecciones por este patógeno en el ganado porcino, así como sobre la posibilidad de un origen común para múltiples cepas en los brotes de salmonelosis humana.
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Base genética del tropismo de lentivirus de pequeños rumiantes y estudio de la resistencia innata por APOBEC3
(2015) Glaría Ezquer, Idoia; Reina Arias, Ramsés; Andrés Cara, Damián de; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Los lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV), que incluyen al virus Visna/Maedi (VMV) y al de la artritis encefalitis caprina (CAEV), infectan ovejas y cabras distribuidas por todo el mundo causando un cuadro multisistémico que afecta articulaciones, pulmones, glándula mamaria y sistema nervioso central. Las pérdidas derivadas de la infección van desde el aumento en la tasa de reposición, a un descenso en las producciones animales o en el valor comercial del rebaño. Aunque la enfermedad causada por los SRLV es de carácter lento y generalmente afecta a pulmones y glándula mamaria en nuestro país, se han descrito brotes epidemiológicos causantes de artritis y encefalitis en ovinos que afectan un gran número de animales, causando pérdidas directas. En la actualidad existen 5 genotipos descritos (A‐E) que presentan una alta variabilidad genética y biológica. Los genotipos A y B a los que pertenecen las estirpes clásicas de VMV y CAEV respectivamente, están distribuidos mundialmente, mientras que los genotipos C y E están restringidos a zonas geográficas concretas. En ausencia de tratamientos o vacunas totalmente protectoras, las medidas de control se basan en la detección temprana de animales infectados y su posterior eliminación del rebaño. Tras la infección, los animales infectados desarrollan una respuesta de anticuerpos que, si bien no es capaz de eliminar el virus, es indicadora de la infección. Así, empleando métodos de detección serológica podemos diagnosticar la infección indirectamente. Los métodos más eficaces hasta el momento son los ELISAs basados en proteínas recombinantes y péptidos sintéticos. Sin embargo, los métodos disponibles en el comercio están diseñados teniendo en cuenta una única estirpe viral, que sumado a la alta variabilidad antigénica de los SRLV, hace que las medidas disponibles fallen a la hora de controlar todo el espectro antigénico presente. La organización genómica de los lentivirus está bastante conservada entre los miembros del género. Así, a los genes estructurales gag, pol y env encargados de codificar proteínas de la cápside, proteínas para la replicación del material genético e integración y las proteínas de la envoltura, respectivamente, hay que sumarles los accesorios vpr, rev y vif en el caso de los SRLV, todos ellos flanqueados por el regulador de la transcripción viral, la región LTR. En la patogénesis de las enfermedades lentivirales es esencial conocer las interacciones entre el virus y el hospedador que determinan el tropismo y el desarrollo de los síntomas. Los factores virales incluyen las proteínas de la envoltura, encargadas de unirse al receptor celular y la región LTR encargada de regular la actividad transcripcional. Los factores del hospedador son más diversos ya que pueden incluir todo el fondo genético de una raza o una población determinada capaz de restringir la replicación viral de manera efectiva. Uno de los pasos clave en el establecimiento de la infección es la superación de las barreras de la inmunidad innata, que reconocen directamente determinantes virales e inducen la eliminación del patógeno mediante factores de restricción como APOBEC3. La caracterización genética y virológica de las estirpes implicadas en los brotes epidemiológicos de artritis y encefalitis, puede aportar hallazgos esenciales en el conocimiento de la relación entre la secuencia genética de los aislados y la capacidad para establecer la infección en un tejido determinado. Por otro lado, componentes de la inmunidad innata del hospedador capaces de inhibir la replicación viral pueden ser también determinantes del tropismo. Por todo ello en esta tesis nos planteamos los siguientes estudios: a) Aislamiento y caracterización genética de estirpes implicadas en el brote artrítico. b) Aislamiento y caracterización genética de estirpes implicadas en el brote de encefalitis. c) Caracterización de la restricción de los SRLV por APOBEC3.
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Biotechnological development of a new bioinsecticide based on a Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus from Spain
(2015) Arrizubieta Celaya, Maite; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
El taladro del tomate, Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), es una de las principales plagas polífagas de la Península Ibérica. El nucleopoliedrovirus simple de H. armigera (HearSNPV) es un método eficaz para el control de dicha especie. En esta tesis, se evaluó la diversidad genotípica de dos aislados españoles del HearSNPV con el objetivo de seleccionar una mezcla de genotipos con mejores características insecticidas. La caracterización biológica reveló que la mezcla co-ocluida de dos genotipos (HearSP1B:LB6), en proporción 1:1, presenta propiedades insecticidas mejoradas, por lo que fue seleccionada como materia activa de un nuevo bioinsecticida. Con el objetivo de detectar los cambios genéticos responsables de estas diferencias en el fenotipo, se realizó la secuenciación completa del genoma de 5 genotipos. Las mayores diferencias entre todos estos genotipos se localizan en las hrs y en los genes bro. Además, se identificaron mutaciones puntuales en genes implicados en la replicación del ADN, la transcripción viral, o genes estructurales, que podrían ser responsables de la reducida producción de OBs de los genotipos de HearSP1 o el aumento de la patogenicidad de HearSP1B. También, se identificaron diversas mutaciones localizadas en los genes iap-2, iap-3 y hoar que podrían estar relacionadas con la estrategia de transmisión o con la capacidad para establecer infecciones encubiertas en el insecto huésped. Con el objetivo de ampliar el espectro de huéspedes de HearSNPV se aplicó la tecnología de co-oclusión de baculovirus para obtener muestras de OBs en las que se encontrasen co-envueltos HearSNPV y HearMNPV, para obtener una mezcla con las características insecticidas deseables de HearSNPV y el amplio espectro de huéspedes de HearMNPV. Cuando larvas de H. armigera fueron infectadas primero con HearMNPV y 12 o 24 horas más tarde con HearSNPV, los genomas de ambos se co-ocluyeron en los OBs en la misma proporción (1:1). Sin embargo, la mezcla co-envuelta no presentó mejores características fenotípicas, pero aumentó el espectro de huéspedes de HearSNPV, ya que este virus fue capaz de entrar e infectar a especies no susceptibles como S. frugiperda y M. brassicae. Con el fin de optimizar las condiciones para la producción masiva del virus, se evaluó el efecto de varios factores sobre la producción de cuerpos de oclusión (OBs). Los resultados obtenidos mostraron que la mayor producción de OBs se consigue inoculando larvas L5 recién mudadas con la CL80, e incubando las larvas individualizadas a 30ºC. La eficacia y la persistencia en campo de un formulado sencillo del nuevo bioinsecticida se compararon con las de varios insecticidas comerciales en cultivos de tomate en invernadero y en campo abierto. Dicho formulado protegió al cultivo con una eficacia similar a la de los insecticidas comerciales Dursban®, Turex® y Spintor®. En cambio, su persistencia fue mayor que la de los insecticidas comerciales, aunque las diferencias fueron más notables en los cultivos de invernadero. Toda esta información ha sido objeto de una solicitud de patente (P201430956), y constituye la base para el desarrollo de un nuevo bioinsecticida. Este nuevo bioinsecticida es una herramienta muy útil para el establecimiento de una agricultura sostenible en los cultivos de tomate en la Península Ibérica, ya que puede ser incluido en programas de Manejo Integrado de Plagas.
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Efecto de la utilización de pienso enriquecido en ácidos grasos poliinsaturados en corderos en crecimiento sobre el desarrollo, la composición de la grasa de la carne y la expresión de los principales genes lipógenos del tejido adiposo
(2016) Urrutia Vera, Olaia; Arana Navarro, Ana; Soret Lafraya, Beatriz; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
En los últimos años, el aporte de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de tipo n-3 en la alimentación animal es una vía que está siendo estudiada para mejorar el perfil lipídico de la carne, debido a que es un alimento con una proporción considerable de ácidos grasos saturados que se asocian a ciertas enfermedades crónicas y además existe un interés creciente por consumir alimentos más saludables. Sin embargo, algunos estudios muestran que el aumento de ácidos grasos saludables como el ácido a-linolénico (ALA), el ácido eicosapentaenoico (EPA), el ácido docosahexaenoico (DHA) y el isómero C18:2 c9t11 del ácido linoleico conjugado (CLA) en la carne tras la adición de fuentes de PUFA en las dietas de los animales no es muy significativo. Las hipótesis planteadas para esta discordancia apuntan a la regulación de la expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio ha sido valorar el efecto de la incorporación materias primas ricas en PUFA (semilla de lino y chía ricas en ALA y microalgas marinas con un alto contenido en DHA) en la alimentación de corderos de raza Navarra durante el cebo de sobre las características de crecimiento y de la canal, el desarrollo del tejido graso y la composición en ácidos grasos de la carne y de la grasa, además de analizar varios parámetros relacionados con la calidad de la carne y valorar su aceptabilidad por parte de los consumidores. Por último, con objeto de profundizar en la comprensión de los mecanismos moleculares por medio de los cuales los PUFA pueden ejercer su acción en el tejido adiposo, se ha estudiado la expresión de varios genes lipogénicos y adipogénicos.
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Vertical transmission of the Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus and its application in biological control
(2016) Virto Garayoa, Cristina; Caballero Murillo, Primitivo; Murillo Pérez, Rosa; Williams, Trevor; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Las infestaciones de larvas de Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) son muy frecuentes en los cultivos de pimiento de los invernaderos de Almería. En estudios previos, la caracterización molecular e identificación de los aislados del nucleopoliedrovirus múltiple de S. exigua (SeMNPV; Baculoviridae) con mayor potencial insecticida así como el desarrollo de otras tecnologías (producción masiva y formulación) permitieron la obtención de un bioinsecticida que es más efectivo que los plaguicidas químicos convencionales para combatir las plagas de S. exigua en las condiciones de dichos invernaderos. Las aplicaciones de formulados de baculovirus se han realizado principalmente utilizando la modalidad de suelta inundativa, en la cual sólo cabe esperar que ejerza un efecto de control el inóculo liberado. Sin embargo, tras la aplicación de un tratamiento con baculovirus, además de la mortalidad producida por el inóculo liberado, se producen otros efectos sobre las sucesivas generaciones del insecto cuya repercusión en la regulación de las plagas que causa han sido poco estudiados. En esta tesis, básicamente se han analizado y cuantificado algunas interacciones huésped-baculovirus y se aportan datos cualitativos y cuantitativos que pueden servir de base para definir una metodología intermedia entre las sueltas de tipo inundativo e inoculativo.
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The role of plastidic phosphoglucose isomerase in the response of Arabidopsis thaliana to volatile compounds emitted by pathogenic microorganisms
(2016) Sánchez López, Ángela María; Pozueta Romero, Javier; Bahaji, Abdellatif; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
El almidón es un homopolímero ramificado de residuos de glucosa unidos covalentemente a través de enlaces de tipo α-1,4 y α-1,6. Sintetizado en el plastidio, este polisacárido de reserva constituye la forma principal de almacenamiento de carbohidratos en plantas superiores y un determinante importante tanto del crecimiento de la planta como de su relación con el entorno. Está ampliamente aceptado que el proceso de biosíntesis del almidón en hojas tiene lugar exclusivamente en el cloroplasto. Según esta interpretación, el almidón es el producto fi nal de una ruta metabólica conectada con el ciclo de Calvin- Benson (CBC) a través de la fosfoglucosa isomerasa plastidial (pPGI). Esta enzima cataliza la conversión de moléculas de fructosa-6-fosfato del CBC en moléculas de glucosa-6-fosfato, las cuales son metabolizadas en almidón a través de la acción combinada de la fosfoglucomutasa, la ADP-glucosa pirofosforilasa y la almidón sintasa. Las plantas perciben estímulos bióticos mediante el reconocimiento de una gran cantidad de compuestos procedentes de los organismos con los que interactúan. En este sentido cabe destacar que los microorganismos de la rizosfera sintetizan una gran cantidad de sustancias que regulan el desarrollo y el crecimiento de la planta. Además, estos microorganismos emiten una amplia gama de compuestos volátiles (VCs) que actúan como “infoquímicos” en la comunicación entre la planta y el microorganismo. Estudios llevados a cabo por el grupo de investigación en el que he desarrollado este trabajo de tesis doctoral demostraron que los VCs emitidos por una amplia gama de microorganismos (incluyendo patógenos y especies que normalmente no interactúan con la planta) fomentan la acumulación de cantidades excepcionalmente elevadas almidón en la planta. Dada la falta de conocimiento sobre los mecanismos implicados en este fenómeno y teniendo en cuenta a su vez el papel importante que juega el almidón en la interacción de la planta con su entorno, en este trabajo de tesis doctoral investigué las bases moleculares implicadas en la respuesta de la planta a los VCs microbianos, prestando especial atención al papel que juega la pPGI en esta respuesta. El primer capítulo de este trabajo describe la caracterización de dos mutantes (pgi1-2 y pgi1-3) carentes de actividad pPGI. Ambos acumulan en sus hojas un 10- 15% del almidón existente en hojas de plantas salvaje (WT). Contrariamente a lo que pudiera esperarse al tener en cuenta la interpretación clásica de la biosíntesis de almidón, análisis por microscopía revelaron la presencia de gránulos de almidón en cloroplastos de las células del mesófi lo de estos mutantes. Tanto pgi1-2 como pgi1-3 mostraron un crecimiento lento, una reducida capacidad fotosintética y un bajo balance NAD(P)H/NAD(P) con respecto a plantas WT. Estudios hormonómicos mostraron que el contenido de citoquininas (CKs) plastidiales en hojas pgi1 es muy reducido con respecto al existente en hojas WT. Además la aplicación exógena de CKs revirtió el fenotipo de defi ciencia de almidón de hojas de plantas pgi1. Los datos presentados en este trabajo indican que pPGI es un importante determinante de la fotosíntesis, el estado redox de la célula, el crecimiento y la acumulación de almidón en células del mesófi lo como consecuencia de su implicación en la producción de intermediarios de la vía oxidativa de las pentosas fosfato/glicólisis necesarios para la síntesis CKs plastidiales y poder reductor. El capítulo 2 muestra que VCs emitidos por microorganismos fi logenéticamente distantes (incluyendo bacterias y hongos benefi ciosos y patógenos) promueven el crecimiento, la acumulación de niveles excepcionalmente elevados de almidón y la fl oración en varias especies de plantas, incluidos cultivos de interés agronómico. Además, plantas de Arabidopsis expuestas a VCs emitidos por el fi topatógeno Alternaria alternata experimentaron un incremento en la fotosíntesis y un aumento del contenido de CKs. La magnitud de este fenómeno fue reducida en el mutante 35S:AtCKX1 defi ciente en CKs y en el mutante ahk2/3 de señalización de CKs, proporcionando así evidencia de que este tipo de hormonas juega un papel importante en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. El análisis transcriptómico de hojas de Arabidopsis expuestas a VCs de A. alternata reveló cambios en la expresión de genes regulados por luz y CKs implicados en la fotosíntesis, la fl oración, el crecimiento y el metabolismo del almidón. Sorprendentemente, una gran cantidad de genes diferencialmente expresados en plantas tratadas con VCs de A. alternata son genes cuya expresión se ve alterada también en plantas expuestas a VCs emitidos por la bacteria benefi ciosa Bacillus subtilis GB03, sugiriendo que las plantas han desarrollado la capacidad de reaccionar a VCs emitidos por diferentes microorganismos a través de la activación o estimulación de mecanismos altamente conservados. Para entender mejor los mecanismos implicados en las respuestas de las plantas a los VCs emitidos por microorganismos e investigar en qué medida pPGI está implicada en este fenómeno, en el trabajo presentado en el capítulo 3 se caracterizó la respuesta del mutante pgi1-2 a los VCs emitidos por A. alternata. VCs emitidos por este hongo fi topatógeno promovieron el crecimiento, la fotosíntesis y la acumulación de CKs plastidiales en hojas pgi1-2. Contra todo pronóstico, VCs emitidos por A. alternata promovieron la acumulación de niveles excepcionalmente elevados de almidón en hojas pgi1-2. Análisis proteómicos revelaron que los VCs microbianos promueven cambios en la acumulación de proteínas involucradas en la fotosíntesis, el metabolismo del almidón y el crecimiento que pueden explicar las respuestas observadas en plantas pgi1-2. Los datos presentados en este capítulo muestran que las plantas de Arabidopsis son capaces de responder a VCs microbianos mediante la activación o la estimulación de mecanismos independientes de pPGI.
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Study of the molecular mechanisms underlying Bap-mediated cell-cell interactions in Staphylococcus aureus
(2016) Taglialegna, Agustina; Lasa Uzcudun, Íñigo; Valle Turrillas, Jaione; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
La mayoría de los microorganismos son capaces de vivir en comunidades sésiles, siendo esta forma de crecimiento bastante más frecuente que la forma de vida planctónica. En estas comunidades microbianas, conocidas como biofilms, las células crecen adheridas a un sustrato y embebidas en una matriz exopolimérica que ellas mismas producen, y que confiere numerosas ventajas a la población: integridad estructural, protección ante factores externos, y control de la absorción de nutrientes. La composición de esta matriz extracelular es sumamente compleja, variando entre diferentes especies bacterianas y siendo muy susceptible a los cambios que puedan ocurrir en el ambiente circundante. Aproximadamente el 97% de la matriz es agua; el resto es una mezcla de nutrientes, metabolitos, productos de la lisis celular y polímeros secretados (polisacáridos, lípidos, DNA, proteínas). Staphylococcus aureus, una bacteria comensal y patógena causante de numerosas infecciones agudas y crónicas tanto en animales como en humanos, tiene la capacidad de desarrollar biofilms sobre una gran diversidad de superficies vivas e inertes. Esto representa para la bacteria un importante factor de virulencia que aumenta su persistencia y patogenicidad. Por ello, la sociedad científica ha dedicado grandes esfuerzos a lo largo de las ultimas décadas en descifrar la composición de la matriz extracelular estafilocócica, las características estructurales de sus elementos, así como las vías de regulación y los procesos moleculares que controlan su composición. Estudios recientes han puesto de manifiesto que las proteínas son uno de los componentes mayoritarios de la matriz extracelular de S. aureus, sin embargo, actualmente poco se sabe acerca de los aspectos relacionados con su organización espacial en la matriz del biofilm y de las interacciones moleculares con otros componentes de la matriz extracelular o de la célula huésped. En el presente trabajo, hemos estudiado los mecanismos moleculares mediante los cuales la proteína Bap (Biofilm associated protein) es capaz de inducir la interacción intercelular en S. aureus. Bap es una proteína de alto peso molecular que se encuentra anclada covalentemente a la superficie bacteriana mediante un mecanismo dependiente de la enzima sortasa. Hemos determinado que la proteína Bap interconecta células de S. aureus a través de un proceso de autoensamblaje que da lugar a agregados de tipo amiloide en respuesta a determinadas condiciones ambientales. Mas específicamente, nuestros resultados indican que Bap sufre un procesamiento en el que se liberan fragmentos que contienen la región N-terminal. Esta región tiene una conformación de tipo glóbulo fundido (molten-globule) que cambia a una estructura rica en láminas β cuando el pH se acidifica. El estado glóbulo fundido de los fragmentos N-terminales de Bap se caracteriza por poseer una estructura terciaria poco organizada. Sin embargo, cuando se organiza en laminas β tiene tendencia a polimerizar para formar fibras de tipo amiloide. La transición de Bap desde glóbulo fundido a lamina-β no ocurre en presencia de calcio. La unión del calcio a los dominios EF-hand presentes en la región N-terminal de Bap estabiliza la conformación de glóbulo fundido impidiendo la transición a lamina β y el subsecuente ensamblaje de las fibrillas amiloides. Estos resultados indican que Bap juega una doble función en el proceso de formación del biofilm, primero como sensor de condiciones ambientales externas, y segundo como modulo para la construcción de un andamiaje proteico que sustente la matriz del biofilm en determinadas situaciones ambientales. Este comportamiento multicelular dependiente de pH está conservado en proteínas Bap presentes en otros estafilococos coagulasa negativos. La existencia de proteínas homólogas a Bap en otras bacterias sugiere que este mecanismo de agregación amiloide como estrategia para formar la matriz del biofilm, está conservado en bacterias.
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Transposable elements in basidiomycete fungi: dynamics and impact on genome architecture and transcriptional profiles
(2017) Castanera Andrés, Raúl; Ramírez Nasto, Lucía; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Transposable elements (TE), also known as mobile elements or transposons, are enigmatic genetic units that have played important roles in the evolution of eukaryotes. Their impact on genome architecture and phenotypic traits has been widely studied in plants and animals, ever since their discovery in maize during the 1950s by Barbara McClintock. Their ability to move from one locus to another makes them natural tools for generating diversity, as this characteristic leads to genomic alterations with deleterious, neutral, or beneficial effects on hosts. Thus, their survival in the genome depends on the equilibrium between their own benefit and their host’s “permissibility.” Plant and animal TEs have received much attention, yet very little is known about their occurrence and impact on the fungal kingdom. In fact, the first fungal TE was described in Neurospora crassa in 1989, about 40 years later than the discovery of the first TE in plants. Today, revolutionary advances in genome sequencing have opened the possibility of studying non-model species at a whole-genome level. The number of fungal-sequenced genomes increases daily at an unprecedented rate, and most efforts are being concentrated on basidiomycetes, a group of fungi of great interest due to their role in natural ecosystems and their use in multiple industrial applications. In this sense, the amount of genomic information released offers a unique opportunity to start deciphering the effect that mobile, repetitive elements have on fungal genomes. At the time of the start of this PhD thesis (January 2013), very little information regarding basidiomycete TEs existed, as most research was focused on the functional characterization of protein-coding genes. In light of these precedents, the main topics covered in this work are the distribution, characteristics, and impact of transposons in fungal genomes, with an emphasis on basidiomycetes. Using Pleurotus ostreatus as a working model, bioinformatics pipelines have been developed to dig into the extensive genomic data to obtain high quality TE annotations. This approach has allowed for the quantification and characterization of the transposon load of many fungal species and for the testing of hypotheses about the effect that TE insertions produce at the genomic and transcriptomic level.
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Biología de plásmidos y dinámica génica en el complejo Pseudomonas syringae
(2017) Añorga García, Maite; Murillo Martínez, Jesús; Bardají Goikoetxea, Leire; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
La mayoría de las cepas de Pseudomonas syringae posee uno o más plásmidos nativos tipo PFP, que suelen albergar genes adaptativos y que facilitan el intercambio de los mismos entre poblaciones bacterianas. P. syringae pv. savastanoi NCPPB 3335 causa la tuberculosis del olivo (Olea europaea) y es un patógeno modelo para el estudio de la patogénesis bacteriana en plantas leñosas. Esta cepa contiene tres plásmidos PFP estables que han sido completamente secuenciados —pPsv48A, 80 kb; pPsv48B, 45 kb, y pPsv48C, 42 kb— y que portan varios posibles genes de virulencia. A pesar de la importancia de los plásmidos PFP en el ciclo de vida de P. syringae, todavía se desconocen muchos aspectos de su genética y biología, por lo que en esta Tesis nos hemos propuesto los siguientes objetivos: 1) identificación y caracterización funcional de un segundo origen de replicación presente en el plásmido nativo pPsv48C de Ps pv. savastanoi NCPPB 3335; 2) identificación de determinantes de mantenimiento presentes en los plásmidos de la cepa NCPPB 3335 y evaluación de su contribución al mantenimiento de dichos plásmidos, y 3) evaluación del papel del plásmido pPsv48C en la patogenicidad y virulencia de la cepa NCPPB 3335 en su interacción con su planta huésped, olivo. Hemos identificado un segundo replicón en pPsv48C, que es una quimera por compartir su región de control y promotor con el replicón no homólogo RepA-PFP. Hemos demostrado que este tipo de quimeras es frecuente en al menos cuatro familias de replicasas no homólogas de Pseudomonas, incluyendo bacterias patógenas de plantas, animales y humanos. Estos replicones constan de dos módulos funcionales e independientes correspondientes a las regiones de control (módulo REx-C), que actúa como determinante de incompatibilidad, y de replicación (módulo REx-R). Mediante ensayos funcionales, hemos determinado que los tres plásmidos de NCPPB 3335 utilizan diversas estrategias y mecanismos para aumentar su estabilidad. Así, la presencia de estos dos replicones, y especialmente del replicón RepJ, confiere una alta estabilidad a pPsv48C. Además, hemos documentado que los elementos repetitivos IS801 y MITEPsy2 generan frecuentes deleciones y reorganizaciones plasmídicas, cuya frecuencia se reduce por un factor entre 3 y 50 debido a la acción de tres sistemas toxina-antitoxina codificados en pPsv48A y otros tres codificados en pPsv48C. Asimismo, estos sistemas reducen en dos órdenes de magnitud la frecuencia de pérdida espontánea del plásmido pPsv48A y contribuyen al mantenimiento de los genes de virulencia ptz (en pPsv48A) e idi (en pPsv48C). Mediante inactivación funcional de los sistemas de mantenimiento de pPsv48C, hemos obtenido un derivado de NCPPB 3335 curado de sus tres plásmidos nativos (cepa UPN912), que no produce tumores en olivo. Mediante inoculaciones con esta cepa y con mutantes específicos hemos demostrado que el gen idi —que codifica una posible isopentenil difosfato isomersa y éstá probablemente implicado en la biosíntesis de citoquininas— es esencial para la producción de tumores de tamaño silvestre tanto en plantas micropropagadas como en olivos lignificados. En conjunto, nuestros resultados indican que la cepa NCPPB 3335 contiene tres plásmidos nativos de virulencia, que están expuestos a frecuentes eventos de reorganización genética cuyo efecto se ve contrarrestado por la existencia de múltiples determinantes plasmídicos de estabilidad, que a la vez contribuyen a disminuir la pérdida espontánea de los plásmidos y al mantenimiento de genes de virulencia durante el ciclo de vida de la bacteria.
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Chrysodeixis chalcites nucleopolyhedrovirus: a useful component for IPM programs on the Canary Islands banana crops
(2017) Fuentes Barrera, Ernesto Gabriel; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Hernández Suárez, Estrella; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
La platanera (Musa acuminata Colla) es uno de los principales cultivos de las Islas Canarias, representando el 30% de la producción agrícola total del archipiealago. Dicho cultivo se realiza bajo invernaderos de malla principalmente en las vertientes cálidas del sur de las islas, y al aire libre en las frías vertientes del norte. Por ello, los cultivos bajo malla presentan mayores poblemas fitosanitaríos. Chrysodeixis chalcites (Esper, 1789) (Lepidoptera: Noctuidae) ha sufrido cambios importantes en su hábitos alimenticios. Actualmente se alimenta principalmente de los frutos de platanera, produciendo dafios en la epidermis que reducen claramente su valor comercial. El control de dicha plaga implica el uso repetido de un reducido número de materias activas, lo que favorece la aparición de resistencia, y por lo tanto disminuyendo su efectividad. Además, desde el año 2014 la gestión integrada de plagas (GIP) es de obligado cumplimiento en los sistemas de cultivo españoles. El objetivo de esta tesis ha sido abordar varios algunos aspectos importantes para la implementación de un programa de GIP efectivo en los cultivos de platanera de las Islas Canarias, España. La toma de decisiones efectiva en GIP se basa en la comprensión de las relaciones que se producen entre el número de individuos plaga, la respuesta de las plantas a los daños producidos por dichos individuos y las pérdidas económicas resultantes. Por ello, en la presente tesis se estimó en primer lugar la incidencia y el daño alimenticio producido por C. chalcites, así como las pérdidas de producción debidas al daño directo a la fruta y al coste indirecto derivado de la compra y aplicación de insecticidas. La prevalencia de infestaciones varió entre el 42 y 100% y fue similar en tos dos años de prospecciones. El daño foliar medio (1.5-7.3%) y el daño en fruta (1.0-5.7%) varió significativamente en las islas según el tipo de plantación (vertientes orientadas al norte o al sur) y estación. En general, los daños resultaron similares entre los dos tipos de plataciones, excepto en Gran Canaria y Tenerife, donde se registaron más daños foliares y en fruto, respectivamente , en la vertiente sur. Los daños también fueron similares entre las estaciones, Jo que indica que C. chalcites está presente en el cultivo durante todo el año. El peso de plátanos dañados respecto a la fruta cultivada varió significativamente entre las islas, desde el 0,2% en Tenerife hasta el 4,2% en El Hierro, siendo este daño especialmente importante en primavera. Dicho periodo es el más susceptible para determinar la cantidad y calidad de la fruta cosechada, ya que coincide con el desarrollo del fruto tras la floración. En total se perdieron unas 3.155 toneladas de platano/año, lo que representa el 1,5% de la producción anual (2,68 millones de euros/afio). Además, los costes de control con indoxacarb, el insecticida más utilizado (73%), supondrían unos 240€/ha por ciclo de cultivo. Dado que su uso continuado probablemente favorezca el desarrollo de resistencia, se necesitan nuevos insecticidas para rotar con los pocos productos autorizados . Entre ellos el nucleopoliedrovirus de C. chalcites, ChchNPV (Género Alphabaculovirus, Baculoviridae) resulta ser un insecticida seguro, eficiente y sostenible. El siguiente objetivo fue evaluar el uso potencial de ChchNPV como un nuevo agente de control biológico en GTP. Para ello, primero se estimó Ja prevalencia y diversidad genética de las variantes de ChchNPV presentes en las poblaciones naturales de C. chalcites en Canarias y después se evaluó la eficacia insecticida del aislado más prevalente en comparación con dos insecticidas usados frecuentemente, indoxacarb y Bacillus thuringiensis (Bt), a pequeña escala en plantas jóvenes de platanera en condiciones de invernadero y aire libre. En general, la prevalencia de infección por ChchNPV fue del 2,3%, siendo de 0-13,8% en El Hierro, 0-5,6% en La Palma, 0-4,8% en Tenerife, 0-1% en La Gomera y 0% en Gran Canaria. En plantaciones bajo invernadero, la prevalencia de infección fue el doble (3%) que al aire libre (l,4%). ChchNPV-TF1 fue la variante más abundante (82%) y extendida, por lo que se seleccionó para los ensayos de campo. La aplicación 109 cuerpos de oclusión (OBs)/I de ChchNPV-TF1 redujo significativamente la densidad larvaria y el daño foliar en plantas jóvenes de platanera, al igual que los productos convencionales indoxacarb y Bt. Sin embargo, la mayor mortalidad producida por ChchNPV-TF1 en las larvas recolectadas a lo largo del tiempo sugiere que adquisición de una infección letal ocurre durante un periodo de tiempo más extendido, en comparación con el breve periodo que manifiestan las larvas tratadas con los insecticidas convencionales. Estos resultados indican una mayor persistencia de ChchNPV-TF1 en la p!anta de platanera. El último objetivo de este trabajo abordó la evaluación de la eficacia de ChchNPV-TF1 para proteger los frutos de platanera de los daños producidos por C. chalcites en invernaderos de malla en plantaciones comerciales, durante un ciclo de cultivo completo en comparación con el tratameitno convencional. En los ensayos de 2014, el daño foliar fue similar entre las dos estrategias de control en las tres islas, mientras que el daño en fruto en las parcelas tratadas con ChchNPV-TF1 fue sorprendentemente mayor en Tenerife, pero similar en Gran Canaria y La Palma. En Tenerife y Gran Canaria Ja mortalidad larvaria fue mayor en la parcela tratada con ChchNPV-TFl, mientras en La Palma la baja incidencia no permitió determinar la mortalidad larvaria. En un segundo ensayo en Tenerife en 2015 los tratamientos con virus se aplicaron varios meses antes del dasarrollo del fruto, y esta vez ChchNPV-TF1 proporcionó un control efectivo, similar al proporcionado por los insecticidas convencionales. En conclusión, este nuevo agente de control biológico resulta útil para ser incluido en la gestión integrada de C. chalcites en cultivos de platanera de Canarias. Los resultados de esta tesis forman parte de un trabajo más amplio que tiene como objetivo definir los umbrales de daño de C. chalcites en cultivos de platanera y el uso potencial de este nuevo insecticida biológico.
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Characterization of transposon activity and genome-wide epigenetic regulation throughout the life cycle of Pleurotus ostreatus
(2017) Borgognone, Alessandra; Ramírez Nasto, Lucía; Castanera Andrés, Raúl; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Most prokaryotic and eukaryotic life forms have to deal with the presence of repetitive DNA sequences called transposable elements (TEs), whose ability to mobilize through the genome and insert at random position has an impact on genome stability and functionality. For a long time, TEs were described as ‘selfish’ DNA fragments, owing to their proliferation within the host genome without conferring any benefit or inducing detrimental effects when inserted in gene coding regions. Over time, however, this view was changed by the discovery of the contribution of transposons in genome integrity and evolution. Recent genome-wide characterizations have focused on the distribution of these mobile elements and the effects of active transposon copies within closely related genomes. Given their mutagenic potential, host genomes have evolved endogenous mechanisms to limit the mobilization and repress the transcriptional activity of transposons. In higher organisms, repeat sequences are transcriptionally silenced through epigenetic modifications, which modulate gene expression without producing permanent modifications along the nucleotide sequence. The integrated and dynamic nature of epigenetic pathways, including DNA methylation and RNA-silencing systems, can be regulated at different levels, leading to the targeted silencing of specific genomic regions. Thus, the revolutionary advent of high-throughput sequencing led to an unprecedented opportunity to generate genome-wide epigenetic profiles and extend the understanding of the contribution of TEs in genome evolution. The filamentous fungi, in particular, Neurospora crassa and other ascomycetes, have provided fundamental advances in many of the aforementioned areas. These organisms possess complex epigenetic pathways that are also conserved in other higher eukaryotes to efficiently shut down transposon activity. Despite their importance, the occurrence of epigenetic events as well as the impact of transposon activity in basidiomycetes have been poorly analyzed so far. Recent studies in Pleurotus ostreatus uncovered that the genome of this basidiomycete model is populated by a diverse set of TE families, providing a detailed picture of the distribution and importance of helitrons, which are a group of DNA transposons that mobilize through a rolling-circle mechanism. Therefore, the principal aim of this work is to investigate the inheritance of helitron transposons and profile the epigenetic and transcriptomic landscape of P. ostreatus at different growing stages. Both objectives have been performed through the use of molecular techniques integrated with subsequent Sanger or Next-Generation sequencing data analysis. This PhD dissertation is comprised of four main chapters. Chapter I describes the current state-of-the-art of genome sequencing, transposon identification and epigenetic mechanisms (DNA methylation and RNA silencing pathways); it also provides an introductory overview on the fungal kingdom and the model system P. ostreatus. Chapter II presents the inheritance patterns of HELPO1 and HELPO2 helitron families in the meiotically-derived progeny of P. ostreatus. Our results report the distorted segregation patterns of HELPO2 helitrons that lead to a strong under-representation of these elements in the progeny. Further analyses of the HELPO2 flanking sites showed that the meiotic process of gene conversion may contribute to the elimination of such repetitive elements, favoring the presence of HELPO2 vacant loci. Moreover, the analysis of HELPO2 content in a reconstructed pedigree of subclones maintained under different culture conditions revealed an event of helitron somatic transposition. Additional investigations of genome and transcriptome data indicated that P. ostreatus carries active RNAi machinery that could be involved in the control of transposable element proliferation. These findings provide the first evidence of helitron mobilization in the fungal kingdom and highlight the interaction between genome defense mechanisms and invasive DNA using P. ostreatus as a model. Chapter III describes the occurrence of epigenetic defense strategies in this fungal model. The analyses report a picture of genome-wide epigenetic (DNA methylation and small RNAs) and transcriptional (mRNA) patterns in P. ostreatus throughout its life cycle. High-throughput sequencing analyses (BS-seq, sRNA-seq and mRNA-seq) performed in monokaryon and dikaryon samples revealed epigenetic differences among strains but not within developmental stages. Our results uncovered strain-specific DNA methylation profiles (~ 2 to 7 % global methylation levels) and 21-22nt small RNA production primarily involved in the repression of transposon activity. Furthermore, our findings provide evidence that TE-associated DNA methylation—but not small RNA production—is directly involved in the silencing of genes surrounded by transposons. Finally, these findings also report key genes that are activated in the fruiting process through a comparative analysis of transcriptomes. A general discussion on findings presented in this thesis is given in Chapter IV. This last part reports a critical outlook on the epigenetic and transcriptional state of the two helitron families of the P. ostreatus strains that are differentially subcultured during several years, as well as nucleus-specific methylation variations in dikaryotic strains that share an identical genetic complement but different subculture conditions.