Dpto. Producción Agraria - Nekazaritza Ekoizpena Saila
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Browsing Dpto. Producción Agraria - Nekazaritza Ekoizpena Saila by Author "Añorga García, Maite"
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Publication Open Access Biología de plásmidos y dinámica génica en el complejo Pseudomonas syringae(2017) Añorga García, Maite; Murillo Martínez, Jesús; Bardají Goikoetxea, Leire; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaLa mayoría de las cepas de Pseudomonas syringae posee uno o más plásmidos nativos tipo PFP, que suelen albergar genes adaptativos y que facilitan el intercambio de los mismos entre poblaciones bacterianas. P. syringae pv. savastanoi NCPPB 3335 causa la tuberculosis del olivo (Olea europaea) y es un patógeno modelo para el estudio de la patogénesis bacteriana en plantas leñosas. Esta cepa contiene tres plásmidos PFP estables que han sido completamente secuenciados —pPsv48A, 80 kb; pPsv48B, 45 kb, y pPsv48C, 42 kb— y que portan varios posibles genes de virulencia. A pesar de la importancia de los plásmidos PFP en el ciclo de vida de P. syringae, todavía se desconocen muchos aspectos de su genética y biología, por lo que en esta Tesis nos hemos propuesto los siguientes objetivos: 1) identificación y caracterización funcional de un segundo origen de replicación presente en el plásmido nativo pPsv48C de Ps pv. savastanoi NCPPB 3335; 2) identificación de determinantes de mantenimiento presentes en los plásmidos de la cepa NCPPB 3335 y evaluación de su contribución al mantenimiento de dichos plásmidos, y 3) evaluación del papel del plásmido pPsv48C en la patogenicidad y virulencia de la cepa NCPPB 3335 en su interacción con su planta huésped, olivo. Hemos identificado un segundo replicón en pPsv48C, que es una quimera por compartir su región de control y promotor con el replicón no homólogo RepA-PFP. Hemos demostrado que este tipo de quimeras es frecuente en al menos cuatro familias de replicasas no homólogas de Pseudomonas, incluyendo bacterias patógenas de plantas, animales y humanos. Estos replicones constan de dos módulos funcionales e independientes correspondientes a las regiones de control (módulo REx-C), que actúa como determinante de incompatibilidad, y de replicación (módulo REx-R). Mediante ensayos funcionales, hemos determinado que los tres plásmidos de NCPPB 3335 utilizan diversas estrategias y mecanismos para aumentar su estabilidad. Así, la presencia de estos dos replicones, y especialmente del replicón RepJ, confiere una alta estabilidad a pPsv48C. Además, hemos documentado que los elementos repetitivos IS801 y MITEPsy2 generan frecuentes deleciones y reorganizaciones plasmídicas, cuya frecuencia se reduce por un factor entre 3 y 50 debido a la acción de tres sistemas toxina-antitoxina codificados en pPsv48A y otros tres codificados en pPsv48C. Asimismo, estos sistemas reducen en dos órdenes de magnitud la frecuencia de pérdida espontánea del plásmido pPsv48A y contribuyen al mantenimiento de los genes de virulencia ptz (en pPsv48A) e idi (en pPsv48C). Mediante inactivación funcional de los sistemas de mantenimiento de pPsv48C, hemos obtenido un derivado de NCPPB 3335 curado de sus tres plásmidos nativos (cepa UPN912), que no produce tumores en olivo. Mediante inoculaciones con esta cepa y con mutantes específicos hemos demostrado que el gen idi —que codifica una posible isopentenil difosfato isomersa y éstá probablemente implicado en la biosíntesis de citoquininas— es esencial para la producción de tumores de tamaño silvestre tanto en plantas micropropagadas como en olivos lignificados. En conjunto, nuestros resultados indican que la cepa NCPPB 3335 contiene tres plásmidos nativos de virulencia, que están expuestos a frecuentes eventos de reorganización genética cuyo efecto se ve contrarrestado por la existencia de múltiples determinantes plasmídicos de estabilidad, que a la vez contribuyen a disminuir la pérdida espontánea de los plásmidos y al mantenimiento de genes de virulencia durante el ciclo de vida de la bacteria.Publication Open Access Miniature transposable sequences are frequently mobilized in the bacterial plant pathogen Pseudomonas syringae pv. phaseolicola(Public Library of Science, 2011) Bardají Goikoetxea, Leire; Añorga García, Maite; Jackson, Robert W.; Martínez Bilbao, Alejandro; Yanguas Casas, Natalia; Murillo Martínez, Jesús; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaMobile genetic elements are widespread in Pseudomonas syringae, and often associate with virulence genes. Genome reannotation of the model bean pathogen P. syringae pv. phaseolicola 1448A identified seventeen types of insertion sequences and two miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs) with a biased distribution, representing 2.8% of the chromosome, 25.8% of the 132-kb virulence plasmid and 2.7% of the 52-kb plasmid. Employing an entrapment vector containing sacB, we estimated that transposition frequency oscillated between 2.6 x 10(-5) and 1.1 x 10(-6), depending on the clone, although it was stable for each clone after consecutive transfers in culture media. Transposition frequency was similar for bacteria grown in rich or minimal media, and from cells recovered from compatible and incompatible plant hosts, indicating that growth conditions do not influence transposition in strain 1448A. Most of the entrapped insertions contained a full-length IS801 element, with the remaining insertions corresponding to sequences smaller than any transposable element identified in strain 1448A, and collectively identified as miniature sequences. From these, fragments of 229, 360 and 679-nt of the right end of IS801 ended in a consensus tetranucleotide and likely resulted from one-ended transposition of IS801. An average 0.7% of the insertions analyzed consisted of IS801 carrying a fragment of variable size from gene PSPPH_0008/PSPPH_0017, showing that IS801 can mobilize DNA in vivo. Retrospective analysis of complete plasmids and genomes of P. syringae suggests, however, that most fragments of IS801 are likely the result of reorganizations rather than one-ended transpositions, and that this element might preferentially contribute to genome flexibility by generating homologous regions of recombination. A further miniature sequence previously found to affect host range specificity and virulence, designated MITEPsy1 (100-nt), represented an average 2.4% of the total number of insertions entrapped in sacB, demonstrating for the first time the mobilization of a MITE in bacteria.Publication Open Access Plasmid replicons from Pseudomonas are natural chimeras of functional, exchangeable modules(Frontiers Media, 2017) Bardají Goikoetxea, Leire; Añorga García, Maite; Ruiz Masó, José A.; Solar, Gloria del; Murillo Martínez, Jesús; Producción Agraria; Nekazaritza EkoizpenaPlasmids are a main factor for the evolution of bacteria through horizontal gene exchange, including the dissemination of pathogenicity genes, resistance to antibiotics and degradation of pollutants. Their capacity to duplicate is dependent on their replication determinants (replicon), which also define their bacterial host range and the inability to coexist with related replicons. We characterize a second replicon from the virulence plasmid pPsv48C, from Pseudomonas syringae pv. savastanoi, which appears to be a natural chimera between the gene encoding a newly described replication protein and a putative replication control region present in the widespread family of PFP virulence plasmids. We present extensive evidence of this type of chimerism in structurally similar replicons from species of Pseudomonas, including environmental bacteria as well as plant, animal and human pathogens. We establish that these replicons consist of two functional modules corresponding to putative control (REx-C module) and replication (REx-R module) regions. These modules are functionally separable, do not show specificity for each other, and are dynamically exchanged among replicons of four distinct plasmid families. Only the REx-C module displays strong incompatibility, which is overcome by a few nucleotide changes clustered in a stem-and-loop structure of a putative antisense RNA. Additionally, a REx-C module from pPsv48C conferred replication ability to a non-replicative chromosomal DNA region containing features associated to replicons. Thus, the organization of plasmid replicons as independent and exchangeable functional modules is likely facilitating rapid replicon evolution, fostering their diversification and survival, besides allowing the potential co-option of appropriate genes into novel replicons and the artificial construction of new replicon specificities.