Tesis doctorales DPA - NES Doktoretza tesiak

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http://hdl.handle.net/2454/14780

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Browsing Tesis doctorales DPA - NES Doktoretza tesiak by browse.metadata.doctorateProgram "Bioteknologiako Doktoretza Programa (ED 99/2011)"

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    Desarrollo de vacunas marcadas con GFP frente a la brucelosis ovina y tests diagnósticos asociados
    (2017) Zabalza Baranguá, Ana; Grilló Dolset, María Jesús; San Román Aberasturi, Beatriz; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
    La brucelosis es una zoonosis extendida mundialmente con importantes repercusiones económicas y sanitarias, cuya principal fuente de infección para el ser humano son los pequeños rumiantes infectados por Brucella melitensis. En gran parte del mundo, el control de la brucelosis en estos animales debe basarse en la vacunación. B. melitensis Rev1 es la única vacuna disponible y recomendada internacionalmente para ovejas y cabras. Sin embargo, la vacunación con Rev1 genera una interferencia serológica que impide la Diferenciación entre Animales Infectados y Vacunados (DIVA), limitando el uso de esta cepa vacunal. Para tratar de solventar el problema DIVA, se ha desarrollado una técnica de marcaje xenogénico con la proteína de origen marino GFP. En el capítulo 1 de esta tesis, se obtuvieron dos isoformas de GFP recombinante y se desarrollaron tests serológicos utilizando dichas proteínas como antígeno diagnóstico. En el capítulo 2, se realizó el marcaje xenogénico de Rev1 con gfp mediante la inserción cromosómica dirigida de un mini-Tn7-gfp (Rev1::gfp) y un análisis serológico detallado, tanto en ratones BALB/c como en ganado ovino. La estrategia de vacunación con Rev1::gfp en mezcla con GFP y un booster posterior con GFP en hidróxido de aluminio, permitió identificar durante más de 6 meses post-booster a todos los animales que habían sido vacunados, utilizando las técnicas serológicas oficiales anti-LPS-S y un iELISA-GFP. Además, la vacuna clásica Rev1 posee otros inconvenientes como son su poder patógeno residual y resistencia a la estreptomicina, que recomiendan la búsqueda de nuevas vacunas frente a B. melitensis. Para ello, en el capítulo 3 se construyeron y caracterizaron los candidatos vacunales 16Δ.wzm y 16Δ.wzm::gfp, con LPS-R, a la vez que acumulan PS-0 en el interior bacteriano, y sensibles a estreptomicina. Estas propiedades confirieron una atenuación y eficacia frente a B. melitensis en ratones similares a las de Rev1. En corderos, la vacunación combinada de 16Δ.wzm::gfp con GFP generó una mínima interferencia en las pruebas convencionales con LPS-S y permitió identificar a los anímales vacunados mediante iELISA-GFP, sin necesidad de booster. Por otra parte, Rev1 ha permitido controlar la infección por Brucella ovis. En las zonas donde se ha abandonado la vacunación con Rev1, B. ovis es una patógeno emergente que causa graves pérdidas económicas. Puesto que no existe una vacuna específica frente a B. ovis, el capítulo 4 se centró en analizar las propiedades vacunales de una selección de cinco mutantes rugosos de B. melitensis obtenidos en un proyecto anterior, mediante inserción aleatoria del mini-Tn5. De ellos, se seleccionaron y construyeron por deleción en fase las cepas marcadas 16Δ.wzm::gfp (capítulo 3) y H38ΔwbkF::gfp (capítulo 4). Además, se seleccionó un mutante de B. ovis PA que había mostrado buenas propiedades en el modelo murino en un trabajo anterior, para su marcaje con el mini-Tn7-gfp, generando la cepa BoPAiΔomp10ΔugpBΔomp31::gfp. La vacunación con una de estas cepas marcadas, tanto por vía intraperitoneal como subcutánea, evidenció mejor protección con los mutantes de B. melitensis que con el triple mutante de B. avis en el modelo murino. Finalmente, se evaluó la inocuidad y respuesta serológica de 16MΔwzm::gfp y BoPAΔomp10iΔugpBfΔomp31::gfp en ganado ovino, tras la vacunación combinada del mutante con GFP y posterior booster con GFP en hidróxido de aluminio, siguiendo el protocolo descrito en el Capítulo 2. Al igual que con Rev1::gfp, esta estrategia permitió identificar por iELISA-GFP a todos los animales que habían sido vacunados, durante más de 4 meses post-booster. En conjunto, por un lado, el marcaje de Brucella con el mini-Tn7-gfp permitió conservar las propiedades microbiológicas y vacunales que poseían los correspondientes mutantes antes de ser marcados y, a su vez, permitió identificarlos fácilmente por visualización directa de la ftuorescencia y por una PCR-GFP múltiple específicamente diseñada. Por otro lado, Rev1::gfp y 16MΔwzm::gfp parecen buenas alternativas a Rev1 frente a infecciones por B. melitensis virulentas.
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    PublicationOpen Access
    Estudio de las bases moleculares de la infección respiratoria por el patógeno bacteriano Haemophilus influenzae: efecto de la auxotrofía metabólica e implementación de un nuevo modelo experimental preclínico
    (2018) Rodríguez Arce, Irene; Garmendia García, Juncal; Farrán Blanch, Inmaculada; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua proyecto 3/2016
    Este trabajo de tesis doctoral se centra en el estudio de las bases moleculares de la infección respiratoria por la bacteria Haemophilus influenzae, miembro del microbioma respiratorio humano y patógeno oportunista de especial relevancia en la progresión de la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC).
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    PublicationOpen Access
    Functional analysis of the RNA chaperone CspA in Staphylococcus aureus
    (2018) Caballero Sánchez, Carlos; Toledo Arana, Alejandro; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
    En esta tesis se pone de manifiesto que las chaperonas de RNA, como CspA, pueden interactuar de manera específica con estructuras de RNA, que a su vez pueden ser reconocidas por otras RBPs. Esto contribuye a un mejor entendimiento de la regulación mediada por este grupo de chaperonas de RNA. Además, se destaca la importancia de los elementos reguladores intrínsecos, presentes en cada mRNA, y se propone que la interacción de dichos elementos con distintas RBPs es un factor clave para la correcta expresión proteica que, en última instancia, permite el adecuado desarrollo de todos los seres vivos.
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    PublicationOpen Access
    Patho-adaptive evolution of Haemophilus spp. bacterial respiratory colonizing opportunistic pathogens
    (2018) Moleres Apilluelo, Javier; Garmendia García, Juncal; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
    Esta tesis doctoral se ha centrado en tres aspectos de la pato-adaptación de dos especies bacterianas relacionadas filogenéticamente, que colonizan de forma asintomática y también son patógenos oportunistas en los sistemas respiratorios porcino y humano, respectivamente. Para ello, hemos analizado rasgos de evolución patoadaptativa bacteriana en un modelo de trabajo experimental (Capítulo 2) y de forma natural dentro del hospedador (Capítulos 1 y 3).
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    PublicationOpen Access
    The role of plastidic phosphoglucose isomerase in the response of Arabidopsis thaliana to volatile compounds emitted by pathogenic microorganisms
    (2016) Sánchez López, Ángela María; Pozueta Romero, Javier; Bahaji, Abdellatif; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
    El almidón es un homopolímero ramificado de residuos de glucosa unidos covalentemente a través de enlaces de tipo α-1,4 y α-1,6. Sintetizado en el plastidio, este polisacárido de reserva constituye la forma principal de almacenamiento de carbohidratos en plantas superiores y un determinante importante tanto del crecimiento de la planta como de su relación con el entorno. Está ampliamente aceptado que el proceso de biosíntesis del almidón en hojas tiene lugar exclusivamente en el cloroplasto. Según esta interpretación, el almidón es el producto fi nal de una ruta metabólica conectada con el ciclo de Calvin- Benson (CBC) a través de la fosfoglucosa isomerasa plastidial (pPGI). Esta enzima cataliza la conversión de moléculas de fructosa-6-fosfato del CBC en moléculas de glucosa-6-fosfato, las cuales son metabolizadas en almidón a través de la acción combinada de la fosfoglucomutasa, la ADP-glucosa pirofosforilasa y la almidón sintasa. Las plantas perciben estímulos bióticos mediante el reconocimiento de una gran cantidad de compuestos procedentes de los organismos con los que interactúan. En este sentido cabe destacar que los microorganismos de la rizosfera sintetizan una gran cantidad de sustancias que regulan el desarrollo y el crecimiento de la planta. Además, estos microorganismos emiten una amplia gama de compuestos volátiles (VCs) que actúan como “infoquímicos” en la comunicación entre la planta y el microorganismo. Estudios llevados a cabo por el grupo de investigación en el que he desarrollado este trabajo de tesis doctoral demostraron que los VCs emitidos por una amplia gama de microorganismos (incluyendo patógenos y especies que normalmente no interactúan con la planta) fomentan la acumulación de cantidades excepcionalmente elevadas almidón en la planta. Dada la falta de conocimiento sobre los mecanismos implicados en este fenómeno y teniendo en cuenta a su vez el papel importante que juega el almidón en la interacción de la planta con su entorno, en este trabajo de tesis doctoral investigué las bases moleculares implicadas en la respuesta de la planta a los VCs microbianos, prestando especial atención al papel que juega la pPGI en esta respuesta. El primer capítulo de este trabajo describe la caracterización de dos mutantes (pgi1-2 y pgi1-3) carentes de actividad pPGI. Ambos acumulan en sus hojas un 10- 15% del almidón existente en hojas de plantas salvaje (WT). Contrariamente a lo que pudiera esperarse al tener en cuenta la interpretación clásica de la biosíntesis de almidón, análisis por microscopía revelaron la presencia de gránulos de almidón en cloroplastos de las células del mesófi lo de estos mutantes. Tanto pgi1-2 como pgi1-3 mostraron un crecimiento lento, una reducida capacidad fotosintética y un bajo balance NAD(P)H/NAD(P) con respecto a plantas WT. Estudios hormonómicos mostraron que el contenido de citoquininas (CKs) plastidiales en hojas pgi1 es muy reducido con respecto al existente en hojas WT. Además la aplicación exógena de CKs revirtió el fenotipo de defi ciencia de almidón de hojas de plantas pgi1. Los datos presentados en este trabajo indican que pPGI es un importante determinante de la fotosíntesis, el estado redox de la célula, el crecimiento y la acumulación de almidón en células del mesófi lo como consecuencia de su implicación en la producción de intermediarios de la vía oxidativa de las pentosas fosfato/glicólisis necesarios para la síntesis CKs plastidiales y poder reductor. El capítulo 2 muestra que VCs emitidos por microorganismos fi logenéticamente distantes (incluyendo bacterias y hongos benefi ciosos y patógenos) promueven el crecimiento, la acumulación de niveles excepcionalmente elevados de almidón y la fl oración en varias especies de plantas, incluidos cultivos de interés agronómico. Además, plantas de Arabidopsis expuestas a VCs emitidos por el fi topatógeno Alternaria alternata experimentaron un incremento en la fotosíntesis y un aumento del contenido de CKs. La magnitud de este fenómeno fue reducida en el mutante 35S:AtCKX1 defi ciente en CKs y en el mutante ahk2/3 de señalización de CKs, proporcionando así evidencia de que este tipo de hormonas juega un papel importante en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. El análisis transcriptómico de hojas de Arabidopsis expuestas a VCs de A. alternata reveló cambios en la expresión de genes regulados por luz y CKs implicados en la fotosíntesis, la fl oración, el crecimiento y el metabolismo del almidón. Sorprendentemente, una gran cantidad de genes diferencialmente expresados en plantas tratadas con VCs de A. alternata son genes cuya expresión se ve alterada también en plantas expuestas a VCs emitidos por la bacteria benefi ciosa Bacillus subtilis GB03, sugiriendo que las plantas han desarrollado la capacidad de reaccionar a VCs emitidos por diferentes microorganismos a través de la activación o estimulación de mecanismos altamente conservados. Para entender mejor los mecanismos implicados en las respuestas de las plantas a los VCs emitidos por microorganismos e investigar en qué medida pPGI está implicada en este fenómeno, en el trabajo presentado en el capítulo 3 se caracterizó la respuesta del mutante pgi1-2 a los VCs emitidos por A. alternata. VCs emitidos por este hongo fi topatógeno promovieron el crecimiento, la fotosíntesis y la acumulación de CKs plastidiales en hojas pgi1-2. Contra todo pronóstico, VCs emitidos por A. alternata promovieron la acumulación de niveles excepcionalmente elevados de almidón en hojas pgi1-2. Análisis proteómicos revelaron que los VCs microbianos promueven cambios en la acumulación de proteínas involucradas en la fotosíntesis, el metabolismo del almidón y el crecimiento que pueden explicar las respuestas observadas en plantas pgi1-2. Los datos presentados en este capítulo muestran que las plantas de Arabidopsis son capaces de responder a VCs microbianos mediante la activación o la estimulación de mecanismos independientes de pPGI.