Person: Fernández de los Reyes, Irene
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Fernández de los Reyes
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Irene
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Ciencias de la Salud
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0000-0001-9762-7173
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812797
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Publication Open Access Análisis del valor clínico de nuevos marcadores moleculares e inmunohistoquímicos según el subtipo de expresión del cáncer de colon(2024) Fernández de los Reyes, Irene; Gómez Dorronsoro, María Luisa; Guerrero Setas, David; Ciencias de la Salud; Osasun ZientziakLa presente tesis doctoral, ha pretendido identificar biomarcadores pronósticos aplicables en la práctica clínica en CC en estadio II-III, mediante el estudio de metilación aberrante en los cuatro genes diferencialmente expresados en CMS4 y utilizados como marcadores subrogados: CDX2, HTR2B, FRMD6 y ZEB1. Para ello, se han reclutado un total de 144 pacientes con CC esporádico en estadio II-III. En primer lugar, se ha realizado la clasificación molecular subrogada por inmunohistoquímica de los pacientes a partir de TMAs (microarrays de tejidos), sobre los que se han realizado las técnicas inmunohistoquímicas (IHQ) MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, CDX2, HTR2B, FRMD6 y ZEB1. Se identificaron 18 pacientes con alteración de proteínas reparadoras (12,5% CMS-IHQ1), 117 pacientes (80,6%) se clasificaron en el grupo CMS-IHQ2/3 y 9 pacientes (6,3%) en el subtipo CMS-IHQ4. El valor clínico de los subtipos valorado mediante la evaluación de supervivencia mostró que CMS-IHQ1 presentaba el mejor pronóstico, siendo significativamente distinto a CMS-IHQ4, grupo con peor pronóstico, observando un pronóstico intermedio en el grupo CMSIHQ2/3. De esta manera, pueden detectarse subtipos subrogados con distinto pronóstico (CMSIHQ1vs CMS-IHQ4). En segundo lugar, se realizó la pirosecuenciación de los genes subrogados CDX2, FRMD6 y ZEB1, a partir de ADN modificado con bisulfito de 144 bloques de tejido tumoral fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) y de 40 bloques de tejido no tumoral FFPE control. No fue posible diseñar cebadores para analizar el patrón de metilación del promotor del gen HTR2B debido a la elevada densidad de CpGs. En tercer lugar, se analizó la expresión de ZEB1 mediante qRT-PCR a partir de ARN de 20 bloques de tejido tumoral FFPE y de 20 bloques de tejido no tumoral FFPE control, en la que se observó una diferencia de expresión estadísticamente significativa, observándose en los casos hipermetilados una menor expresión de ZEB1 respecto a los casos no metilados (p=0,035). Esta expresión no tuvo concordancia con el estudio IHQ de ZEB1 en el TMA, ni en el estudio IHQ de cortes completos del tumor. Posteriormente, se realizó la pirosecuenciación del gen ZEB1 a partir de ADN modificado con bisulfito de las líneas celulares HCT116, HT29, LoVo, RKO, SW480, SW837, T84, DLD1 y SW620. El gen ZEB1 se encontró hipermetilado en las líneas celulares DLD1, HCT116, HT29 y SW837 (94.5%, 80,5%, 96 % y 49%, respectivamente). Por el contrario, ZEB1 estaba completamente desmetilado en las células de la línea RKO (0%) y con baja metilación en las células LoVo, SW480, SW620, y T84 (3%, 5,5%, 2% y 4,5% respectivamente). La presencia o ausencia de hipermetilación del promotor de ZEB1 aporta un nuevo dato a las características propias de cada línea celular. Por último, se realizó el estudio de expresión de ZEB1 mediante qRT-PCR en las líneas con mayor nivel de metilación antes y después realizar un tratamiento de desmetilación con el agente desmetilante 5-aza-2ʹ-desoxicitidina (AZA), con el inhibidor de histonas desacetilasa tricostatina A (TSA) y con una combinación de ambos (AZA+TSA). El efecto del tratamiento con AZA, TSA o AZA+TSA sobre los niveles de expresión de ZEB1 en las líneas HCT116 y HT29 (ambas con elevado porcentaje de metilación y alta tasa de crecimiento), reveló una mayor reexpresión del gen ZEB1 en la línea celular HCT116 tratada con AZA (p < 0,0001) y en la línea celular HT29 tratada con AZA-TSA (p = 0,003) de forma transitoria.Publication Open Access ZEB1 hypermethylation is associated with better prognosis in patients with colon cancer(BMC, 2023) Fernández de los Reyes, Irene; Gómez Dorronsoro, María Luisa; Monreal Santesteban, Iñaki; Fernández-Fernández, Agustín; Fraga, Mario; Azcue Sanromán, Pablo; Alonso, Laura; Fernández-Marlasca, Beatriz; Suárez Alecha, Javier; Córdoba Iturriagagoitia, Alicia; Guerrero Setas, David; Ciencias de la Salud; Osasun Zientziak; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate PublikoaBackground: Colon cancer (CC) is a heterogeneous disease that is categorized into four Consensus Molecular Subtypes (CMS) according to gene expression. Patients with loco-regional CC (stages II/III) lack prognostic factors, making it essential to analyze new molecular markers that can delineate more aggressive tumors. Aberrant methylation of genes that are essential in crucial mechanisms such as epithelial mesenchymal transition (EMT) contributes to tumor progression in CC. We evaluate the presence of hyper- and hypomethylation in subrogate IHC markers used for CMS classification (CDX2, FRMD6, HTR2B, ZEB1) of 144 stage II/III patients and CC cell lines by pyrosequencing. ZEB1 expression was also studied in control and shRNA-silenced CC cell lines and in paired normal tissue/tumors by quantitative PCR. The pattern of ZEB1 staining was also analyzed in methylated/unmethylated tumors by immunohistochemistry. Results: We describe for the first time the hypermethylation of ZEB1 gene and the hypomethylation of the FRMD6 gene in 32.6% and 50.9% of tumors, respectively. Additionally, we confirm the ZEB1 re-expression by epigenetic drugs in methylated cell lines. ZEB1 hypermethylation was more frequent in CMS1 patients and, more importantly, was a good prognostic factor related to disease-free survival (p = 0.015) and overall survival (p = 0.006) in our patient series, independently of other significant clinical parameters such as patient age, stage, lymph node involvement, and blood vessel and perineural invasión. Conclusions: Aberrant methylation is present in the subrogate genes used for CMS classification. Our results are the first evidence that ZEB1 is hypermethylated in CC and that this alteration is an independent factor of good prognosis.