Eliminación del gen marcador de selección en plantas transplastómicas mediante la expresión transitoria de la recombinasa CRE

La formación de plantas transgénicas o transplastómicas requiere de la incorporación al genoma, ya sea al nuclear o al plastidial, del gen de interés acompañado de un gen marcador de selección que, generalmente, confiere resistencia a un antibiótico. Una vez que se ha obtenido la planta transgénica o transplastómica, es aconsejable eliminar el gen marcador de selección de la planta debido a la carga genética que supone para las células pero sobre todo al riesgo para la salud humana y animal que implica la posible incorporación de este gen de resistencia a un antibiótico a bacterias patógenas pues puede disminuir la eficacia de los antibióticos. En este trabajo se utilizaron dos variedades transplastómicas de Nicotiana tabacum (tabaco). Estas variedades son: “ Virginia Gold ” y “ Havana 503

B”. Llevan incorporados el gen “tiorredoxina” (“TRX”) y el gen marcador aadA que confiere resistencia al antibiótico espectinomicina y estreptomicina. Se propone un método para la eliminación de este gen marcador que consiste en la expresión transitoria de la recombinasa CRE la cual reconoce las secuencias lox flanqueadoras del gen aadA y suprime el fragmento de ADN que está en medio de estas dos secuencias. Se utilizó la agroinfiltración como método para incorporar la recombinasa CRE en el interior del tejido vegetal y que ésta se exprese de forma transitoria, sin introducirse en el núcleo celular. Se probaron cuatro condiciones diferentes variando la presión de vacío (2 Torr ó 10 Torr) y el tiempo que Agrobacterium estuvo en contacto con los explantos vegetales después de la agroinfiltración (2 ó 4 días). Las plantas obtenidas tras la agroinfiltración se analizaron mediante PCR para chequear la presencia del aadA y las negativas para este gen se analizaron mediante Southern blot. Además, paralelamente se colocaron fragmentos de hoja de las plantas que salieron negativas para la PCR en un medio de cultivo que contenía espectinomicina para comprobar la sensibilidad/resistencia a dicho antibiótico. Aunque algunas de las plantas salieron negativas en la PCR y presentaron sensibilidad a la espectinomicina, el Southern blot confirmó que todas ellas eran portadoras del gen marcador de selección aadA .