Phenotyping in alfalfa: spectral technologies for yield and quality estimations in both laboratory and field conditions

La alfalfa (Medicago sativa L.) es uno de los forrajes más importantes a nivel mundial para la alimentación de ganado. Es una legumbre que provee una alta calidad de forraje, con un considerable contenido en proteínas, carbohidratos y minerales. El cultivo de la alfalfa normalmente es cortada o cosechada varias veces durante un mismo año y muestra un rápido crecimiento después del corte. El monitoreo oportuno y a tiempo del cultivo es cada vez más importante para proveer de un forraje con una calidad adecuada. Sin embargo, agricultores deben enfrentarse a retos no solo para estimar importantes parámetros para la nutrición animal sino también para decidir el óptimo punto de corte con un adecuado balance entre rendimiento y calidad del cultivo. Adicionalmente, en el contexto actual de cambio climático, los sistemas agrícolas deben evolucionar en una actividad más sustentable que reduzca el impacto ambiental y satisfaga las necesidades de una población creciente con los actuales cambios en los hábitos de consumo. Para afrontar estos desafíos en un sistema de producción de forrajes (estimación de rendimiento y calidad, además de identificar el punto óptimo de corte) bajo una perspectiva de cambio climático, es esencial obtener información espacio-temporal en tiempo real. El surgimiento de tecnologías de teledetección aplicadas a la agricultura podría mejorar las estimaciones tradicionales de biomasa y calidad antes de la cosecha. Además, el incremento en la disponibilidad de equipos y plataformas (p.e. satélites, sensores espectrales proximales) podrían dar soporte en la toma de decisiones efectivas para monitorear los cultivos. A pesar de la importancia del papel que cumple la alfalfa en la industria ganadera, el estudio de la aplicación de tecnología de teledetección está más frecuentemente centrada en otros cultivos, como el trigo. Esta tesis tiene como objetivo integrar nuevas perspectivas en el uso de tecnología de teledetección y equipos proximales para estimar los rendimientos y la calidad de la alfalfa en diferentes estados fenológicos del cultivo bajo condiciones de laboratorio y campo. Para esto se usaron espectrómetros de mesa y portátiles miniaturizados en laboratorio (Capítulo I), teledetección pasiva como el satélite Sentinel-2 (Capítulo II) y espectrómetro hiperespectral proximal bajo condiciones de campo (Capítulo III y IV). El Capítulo I examinó la aplicabilidad de un espectrómetro de mesa y cuatro equipos “de mano” para estimar los contenidas de azúcares solubles, almidón, carbono (C), nitrógeno (N) y composición mineral en muestras de alfalfa secas y molidas. Los resultados indicaron que el uso del modelo de regresión mínimos cuadrados parciales (PLS) basado en la reflectancia fue capaz de explicar la variabilidad en el contenido de sacarosa, N, potasio (K) y fósforo (P) con alta precisión cuando el espectrómetro de mano de amplio rango en el espectro (350-2500 nm) fue usado. Los resultados enfatizaron en la viabilidad del uso de equipos portátiles, considerando la alta precisión en las estimaciones y su versatilidad para ser usados tanto en laboratorio como en el campo. El capítulo II evaluó las estimaciones del rendimiento en tres estados fenológicos de desarrollo (vegetativo temprano, vegetativo tardío y botón floral) usando índices de vegetación (VIs) extraídos de imágenes del satélite Sentinel-2 y su combinación con datos meteorológicos. Este capítulo comparó la tradicional regresión multilineal y dos algoritmos de machine learning (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator - LASSO and Random Forest - RF). Los resultados revelaron que las estimaciones de rendimiento no fueron óptimas cuando solos los VIs o los datos meteorológicos se usaron por si solos como predictores en el modelo. Sin embargo, su combinación mejoró significativamente las estimaciones. Además, las estimaciones en vegetativo tardío y botón floral fueron más precisas comparadas con las obtenidas en vegetativo temprano, aunque dichas precisiones se obtuvieron en función del algoritmo usado. Por ejemplo, RF explicó mejor la variabilidad del rendimiento en vegetativo temprano y tardío, mientras que el uso de la regresión multilineal resultó en dar la mejor estimación durante el estadio de botón floral. Los resultados sugieren la posibilidad de extender la generación de estimaciones durante múltiples años para incrementar la precisión de los modelos. La predicción de la biomasa aérea y parámetros de calidad usando un equipo proximal de amplio rango espectral bajo condiciones de campo basa en la reflectancia a nivel de canopy y hoja fue explorado en el Capítulo III. La reflectancia, los grados días de crecimiento acumulados y datos meteorológicos fueron usados como predictores en tres modelos diferentes. Adicionalmente, regiones específicas del espectro asociadas con cada parámetro fueron identificadas. Este capítulo reveló que el rendimiento del modelo difiere entre los parámetros analizados, lo que podría estar relacionado con la variación intraespecífica de cada uno. Los resultados mostraron que las mejores estimaciones, basadas en la alta precisión y coeficiente de determinación, fueron obtenidas para biomasa, y los contenidos de sacarosa, flavonoides y N; para estos parámetros las regiones del visible y el infrarrojo cercano fueron seleccionadas como importantes predictores. Con relación a la estimación del contenido de minerales, los que mejor estimación obtuvieron fueron P, boro (B) y zinc (Zn), y los predictores más importantes fueron seleccionados en la región del infrarrojo cercano de onda corta. En el Capítulo IV, la composición isotópica del C (δ13C) y N (δ15N) y el contenido de aminoácidos fueron estimados bajo condiciones de limitación hídrica para seis variedades de alfalfa usando el equipo hiperespectral en campo. Estos parámetros fueron analizados a lo largo del ciclo de cultivo para explorar la pregunta de si es posible encontrar un potencial biomarcador que pueda indicar el tiempo óptimo de cosecha. Los resultados mostraron que la composición isotópica fue exitosamente estimada con una muy alta precisión, lo que abre la posibilidad de evaluar las respuestas de la planta en condiciones de estrés hídrico, dada la valiosa información del estado vegetal que ofrecen el análisis de los isótopos. Por otra parte, el aminoácido que mejor fue estimado fue el ácido- γ-aminobutírico (GABA) y, además, su contenido disminuyó significativamente en el estado de botón floral, estadio en el cual se recomienda realizar la cosecha ya que en este punto hay un adecuado balance entre rendimiento y calidad. Teniendo en cuenta que este método puede ser aplicado en un amplio rango de ambientes y bajo diferentes condiciones de estrés abiótico, este podría potencialmente contribuir a la cuantificación de otros metabolitos en plantas. Finalmente, perspectivas futuras son mencionadas al final de esta tesis que pueden ayudar a explicar las direcciones a seguir de acuerdo con los resultados obtenidos. En general, esta tesis subraya la necesidad de usar nuevas y eficientes aproximaciones en la adopción de tecnología, así como también en la aplicación de técnicas de ciencia de datos y machine learning para soportar la toma de decisiones en campo. Este punto de vista integral desde el laboratorio al campo o viceversa podría proveer de valioso conocimiento para ser integrado en las ciencias agrícolas.

Alfalfa (Medicago sativa L.) is one of the world's most important forages for livestock feeding. It is a legume that provides of high-quality fodder, with considerable content of protein, carbohydrates and minerals to cattle. Since alfalfa crops typically undergo multiple harvests in a year and demonstrate rapid regrowth, timely monitoring become increasingly critical to secure a satisfactory forage quality. However, farmers face challenges not only to estimate relevant parameters considered for animal nutrition but also to decide the optimal harvesting time with the adequate balance between yield and quality. In addition, from a climate change view, the agricultural systems must develop in a more sustainable activity to reduce the environmental impact and satisfy a growing population with the current change in consumption habits. To tackle substantial challenges in a forage production system (yield and quality estimations, along with identifying optimal harvesting time) in a context of climate change scenarios, it is essential to obtain spatio-temporal information in real-time. The rise of remote sensing technologies applied to agriculture could improve the traditional estimations of alfalfa biomass and quality prior to harvest. Besides, increase of available devices and platforms (e.g. satellite, spectral proximal sensors) might support decision-making for effective monitoring of crops. Despite the important role that alfalfa plays in the livestock industry, attempts to examine the application of remote sensing techniques are often focused on major field crops, such as wheat. This dissertation aims to integrate new remote and proximal sensing perspectives to estimate yield and quality parameters at different phenological stages of alfalfa under lab and field conditions. This was addressed using benchtop and miniaturised spectrometers in laboratory (Chapter I), passive remote sensing such as satellite Sentinel-2 (Chapter II) and proximal sensor in field conditions (Chapter III and IV). Chapter I examined the applicability of one benchtop and four handled-type spectrometers to estimate soluble sugars, starch, carbon (C), nitrogen (N), and mineral content in dried and ground alfalfa samples. The findings indicated that use of partial least square (PLS) regression model based on reflectance was able to explain the variability for sucrose, N, potassium (K), and phosphorus (P) contents with high accuracies when a miniaturised spectrometer of full range (350-2500 nm) was used. The results emphasize the feasibility of using portable devices, considering the high accuracy estimations and their versatility to be used either in the lab or the field. Chapter II assessed the generation of yield estimations models at three phenological stages of development (early vegetative, late vegetative, and budding stages) using vegetation indices (VIs) derived from satellite Sentinel-2 images and their combination with meteorological data. This chapter compared one conventional multilinear regression and two algorithms in the context of machine learning (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator - LASSO and Random Forest - RF). The results revealed that yield estimations were not optimal when either VIs or meteorological data were used singularly as the predictor. However, the combination of VIs and meteorological data significantly improved the yield estimations. In addition, estimations at late vegetative and budding stages were more accurate compared to early vegetative, although such accuracies were achieved depending on the algorithm used. For instance, RF explained better the yield variability at early and late vegetative than the other models, whereas conventional multilinear regression provided the best yield estimation at the bud stage. The chapter’s outcomes suggest the possibility to extend the estimations for multiple years to increase the accuracy of models. The prediction of aboveground biomass and quality parameters using proximal hyperspectral sensor in field conditions based on canopy and leaf reflectance is addressed in Chapter III. The spectra, growing degree days (GDD) and meteorological data were used as predictors in three different models. Additionally, specific region of spectra associated with each parameter were identified. This chapter revealed that the model’s performance differs among parameters analysed, which could be associated with the intraspecific variability of leaf trait. The results showed that the best estimations, based on their high accuracies and high coefficients of determination, were obtained for biomass, sucrose, flavonoids, and N content. For these traits, visible and near infrared region of spectrum were selected as highly important predictors. Regarding to mineral content estimations, P, boron (B) and zinc (Zn) showed the best results, and the most important predictors were selected at the short-wave infrared region. In the Chapter IV, C and N isotopic composition (δ13C and δ15N, respectively) and amino acids contents were estimated under water limited conditions for six alfalfa cultivars using the hyperspectral spectrometer in field. These were analysed throughout crop cycle to explore the question of whether it is possible to find a potential biomarker that could indicates the optimal time of harvest. The results showed that the isotopic composition was successfully estimated with a very high accuracy, which open the possibility of evaluating plant responses under water stress given the valuable information that isotopes offer about plant status. Moreover, the amino acid with the best estimation was for γ-aminobutyric-acid (GABA) in both irrigated and water limited conditions. GABA content presented a considerable decrease at bud stage, point in which the crop harvest is recommended for showing a best balance between yield and quality. Since this method can be applied to different environments or several abiotic stresses, this may potentially contribute to quantifying other metabolites of plants. Finally, future perspectives are given at the end of this thesis that may help explain the directions to follow according to the findings. Overall, this thesis highlighted the need for new efficient approaches in adoption of technology as well as in application of data science and machine learning techniques to support the decisions in field. This integrative point from field to lab could provide valuable knowledge to be integrated in agriculture science.