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Biofuncionalización de nanoestructuras para aplicación en sistemas de detección

La presente tesis doctoral, enmarcada en el campo de nanobiotecnología, presenta el desarrollo de diversas estrategias de biofuncionalización de nanoestructuras con diferentes propiedades con el fin de ser aplicadas en sistemas de detección tipo inmunoensayos e inmunosensores. Este trabajo se aborda desde dos perspectivas: biofuncionalización de (i) nanopartículas y (ii) superficies nanoestructuradas. La primera parte se centra en la evaluación de diversos factores en las características y funcionalidad de conjugados de nanopartículas de oro (AuNPs) y carbono (CNPs) con enzimas y/o anticuerpos. Se comparan las estrategias de unión covalente y adsorción mediante la conjugación de la enzima hierro superóxido dismutasa (FeSOD) a AuNPs a través de un brazo de unión. Se observa que la unión covalente resulta algo más favorable en cuanto a cobertura y actividad enzimática, además de mayor estabilidad frente a variaciones de fuerza iónica y pH del medio, si bien la reproducibilidad de ambas estrategias es algo reducida. Asimismo, se muestra que es posible manipular la disposición de las enzimas secuenciales glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa (HRP) sobre CNPs mediante la modificación del orden de incubación y las proporciones proteína:CNP, lo que afecta a la actividad del complejo. Se comprueba que la GOx presenta mayor afinidad por las CNPs, si bien su actividad se ve afectada, al contrario que la HRP, cuya eficiencia catalítica aumenta tras la unión a CNPs. Por otra parte, se comparan diferentes metodologías de biofuncionalización de AuNPs con anticuerpos y la enzima HRP, adsorción directa, covalente o covalente orientada, con el fin de comparar su potencial para mejorar la sensibilidad del inmunoensayo ELISA. La unión por adsorción proporciona una mayor capacidad de amplificación, consiguiendo un aumento en la sensibilidad en la detección del alérgeno gliadina de seis veces mediante ELISA indirecto. La segunda parte presenta la caracterización de un novedoso biosensor óptico basado en nanoestructuras periódicas de pilares resonantes (RNP) formados por multicapas de SiO2/Si3N4. Se describe el desarrollo del proceso de biofuncionalización de estos materiales dispuestos en nanopilares, aplicando diferentes estrategias de activación, silanización y unión covalente de biomoléculas, llegando a un protocolo de biofuncionalización estable y reproducible. Asimismo, se desarrolla un protocolo para la detección de la interacción antígeno-anticuerpo empleando el modelo IgG-anti-IgG y un formato directo, demostrando la capacidad de los RNP como sensores a tiempo real (real time) y en ausencia de marcadores (label-free). Además, es posible regenerar esta interacción, permitiendo la re-utilización de la superficie. Este procedimiento es empleado para el desarrollo de métodos de medida para la detección de analitos de bajo peso molecular (ácido ocadaico y bifenilo policlorado 169) en el rango de ng/ml aplicando un formato competitivo.

This PhD thesis, included in the field of nanobiotechnology, presents the development of diverse strategies for the biofunctionalization of nanostructures of different properties, to be used in sensing applications such as immunoassays and immunosensors. This work is addressed from two approaches: (i) nanoparticles and (ii) nanostructured surfaces. The first part is focused on the evaluation of various parameters on the properties and functionality of gold (AuNPs) and carbon nanoparticles (CNPs) conjugates with enzymes and/or antibodies. Covalent binding and adsorption strategies are compared by means of conjugation of AuNPs with the enzyme iron superoxide dismutase (FeSOD) through a linker. Covalent binding seems more favorable in terms of coverage and enzymatic activity, and also offers better stability under pH and ionic strength changes, although both methodologies lead to low reproducibility. Additionally, in a bienzyme complex of the sequential enzymes glucose oxidase (GOx) and peroxidase (HRP) on CNPs, the enzyme arrangement can be manipulated by changing the incubation order and protein:CNP proportions, which influences complex activity. GOx shows higher affinity for CNPs, although its activity is strongly affected by CNPs binding. On the contrary, HRP catalytic efficiency is enhanced by CNPs. On the other hand, different methodologies for AuNPs conjugation with antibodies and HRP, i.e. direct adsorption, covalent binding and directional, are compared in order to know their potential to improve ELISA sensitivity. Direct adsorption reveals higher enhancing capacity, leading to a six fold increase in the sensitivity of the detection of gliadin (allergen) by and indirect ELISA. The second part presents the characterization of a novel optical biosensor based on periodic nanostructures of resonant nanopillars (RNP) formed by multilayers of SiO2/Si3N4. The development of the biofunctionalization process for these materials disposed in nanopillars is described. For it, several strategies for the activation, silanization and covalent binding of biomolecules on the surface have been applied, leading to a stable and reproducible biofunctionalization procedure. Additionally, a protocol for the detection of antigen-antibody interaction has been developed, applying the IgG-anti-IgG model and a direct format, showing the suitability of the RNP as real time and label-free biosensors. Moreover, this interaction is regenerable, allowing the use of the surface cyclically. This procedure has been applied for the development of measurement protocols for the detection of low molecular weight analytes (okadaic acid and polychlorinated biphenyl 169) in the range of ng/ml applying a competitive format.