Desarrollo de un método rápido basado en la PCR a tiempo real para recuento de Escherichia coli en leche cruda

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Date
2017Author
Version
Acceso abierto / Sarbide irekia
Type
Trabajo Fin de Grado/Gradu Amaierako Lana
Impact
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nodoi-noplumx
|
Abstract
El hábitat natural de Escherichia coli es el tracto intestinal de humanos y animales y su presencia
en un alimento indica generalmente una contaminación de origen fecal. Esta bacteria es un
microorganismo marcador clásico de calidad higiénica y presencia de patógenos productos
lácteos o el agua.
Para la industria agroalimentaria es de interés desarrollar métodos rápidos, seguros y económicos
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El hábitat natural de Escherichia coli es el tracto intestinal de humanos y animales y su presencia
en un alimento indica generalmente una contaminación de origen fecal. Esta bacteria es un
microorganismo marcador clásico de calidad higiénica y presencia de patógenos productos
lácteos o el agua.
Para la industria agroalimentaria es de interés desarrollar métodos rápidos, seguros y económicos
para la detección de microorganismos marcadores como E. coli. La utilización de metodologías
basadas en el análisis del ADN empleando la PCR a tiempo real (qPCR) permite en pocas horas
realizar el recuento de microorganismos con alta sensibilidad y especificidad.
El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar una técnica de qPCR con sonda TaqMan para
el recuento de E. coli en leche cruda. Se diseñaron cebadores para amplificar un fragmento del
gen uidA, presente en el 97% de las cepas de E. coli. Se optimizó la qPCR para el recuento de E.
coli en cultivo puro (curvas de calibración celular) y se evaluó la técnica en muestras de leche
inoculadas experimentalmente (curva de calibración en leche).
El límite de cuantificación alcanzado fue de 7,3 x 102 u.f.c/mL, lo que se corresponde con 108
copias del genoma de E. coli en la reacción de qPCR, que mostró valores de eficiencia cercanos
al 100% y un valor de Ct de 31,38 ± 0,01. Además, los valores del coeficiente de variación
obtenidos en los estudios de repetibilidad (0,91%) y reproducibilidad (0,74%) del método fueron
bajos, lo que demuestra la adecuada precisión del método. [--]
The principal habitat of Escherichia coli is the intestinal tract of humans and animals and it is
typically spread by fecal-contaminated food or drinking water. E. coli is a classical indicator
bacteria for hygienic quality and the possible presence of pathogens in dairy products and water.
For food industry, it is of interest to develop fast, safe and economical methods for the detection
of ...
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The principal habitat of Escherichia coli is the intestinal tract of humans and animals and it is
typically spread by fecal-contaminated food or drinking water. E. coli is a classical indicator
bacteria for hygienic quality and the possible presence of pathogens in dairy products and water.
For food industry, it is of interest to develop fast, safe and economical methods for the detection
of indicator bacteria such as E. coli. In that respect, the use of methodologies based on DNA
analysis using the real time PCR (qPCR) allows an enumeration of microorganisms in few hours
with high sensibility and specificity.
The objective of the present study was to develop a DNA-based method for enumeration of E.
coli in raw milk. For this purpose, the primers were designed to amplify a fragment of uidA gene,
which is present in 97% of E. coli strains. Optimization of qPCR method for E. coli enumeration
in pure culture was done (cellular calibration curve) and it was evaluated in milk samples
experimentally inoculated with E. coli (milk calibration curve).
The results showed that the limit of quantification was 7.3 x 102
c. f. u/mL, which was comparable
to 108 copies of E. coli genome in qPCR reaction. The reaction efficiency was close to 100% and
the Ct values were 31.38 ± 0.01. Moreover, the coefficient of variation of Ct values obtained by
qPCR were low, being 0.91% on the same day (repeatability) and 0.74% on different days
(reproducibility), indicating that the method developed is precise. [--]
Subject
qPCR,
PCR,
Leche cruda,
Escherichia coli
Degree
Graduado o Graduada en Innovación en Procesos y Productos Alimentarios por la Universidad Pública de Navarra /
Elikagai Prozesuen eta Produktuen Berrikuntzan Graduatua Nafarroako Unibertsitate Publikoan