Genomic, transcriptomic and proteomic analysis of Pleurotus ostreatus secreted proteins

Abstract

The objective of this thesis is to study the proteins secreted by the edible and worldwide cultivated white rot basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus with three major goals: to determine the set of proteins secreted under different nutritional conditions, to determine the effect of the monokaryotic and dikaryotic mycelial conditions on the secretome, and to explore the relationship between the transcriptome of the secreted proteins and the actual secretome in different monokaryotic strains. In the first chapter of this thesis, we will review several basidiomycete secretome analyses comparing the results obtained using different analytical techniques and discussing some representative examples. We will pay a special attention to the lignocellulolytic enzymes secreted and to the different fungal lifestyles. This chapter is an updated version of the paper entitled Comparative analysis of secretomes in basidiomycete fungi that we published in Journal of Proteomics in 2014 as a summary of the state of the art. The main conclusions of this chapter are that a combination of genomic, transcriptomic and proteomics techniques is still the best approach for analyzing fungal secretomes, allowing to the identification of secretion patterns associated to the different lifestyles. In the third chapter, we screened two P. ostreatus monokaryotic genomes to identify bioinformatically the genes coding for proteins targeted for secretion. The study was made using the two monokaryotic protoclones (mkPC9 and mkPC15) whose genomes had been previously sequenced and annotated in a collaborative project carried out with the Joint Genome Institute. These two protoclones contain the two nuclei present in the commercial dikaryotic strains dkN001. The results obtained showed that, surprisingly, both strains differ in their lignocellulose degrading genomic capabilities. mkPC9 have less CAZy genes annotated, especially in the Glycosil hydrolases (GH) class. Nevertheless, mkPC9 grows better than mkPC15 on lignocellulosic substrates and has a higher enzyme secretion capacity when growing in the presence of wood. The transcription of the genes coding for secretable proteins was studied by RNAseq analysis and we could conclude that, whereas the genome profile of the secretome was similar in the two strains, the corresponding transcriptome profiles were different between them and in different culture conditions and we observed a concentrated transcriptional activity in few genes per function and an increased importance of the glycosil hydrolases and proteins without a functional classification. These results highlight the importance of adding additional data to the gene lists produced by genome sequence analysis for gaining a more accurate picture of the biological process under study. P. ostreatus secretes a huge variety of lignocellulose degrading enzymes when cultured in the presence of wood. More than 20% of them lack a known enzymatic function. Transcriptome analysis noted the importance of these proteins, further confirmed by proteomics. Using domain structure prediction, we were able to give an insight about the possible role of several proteins, including a xylanase and a AA10 LPMO. This chapter is a version of the manuscript entitled Comparative and transcriptional analysis of the predicted secretome in the lignocellulose‐degrading basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus published in Environmental Microbiology. Finally, in the fourth chapter, mass spectrometry analyses were used to confirm the presence of these enzymes acting on the lignocellulosic substrates. We compared the proteins secreted by the two monokaryons studied in the bioinformatics analysis with that of dikaryon that contains the two nuclei present in them. Interestingly, monokaryons behave in a very different manner; mkPC15 showed a weakest production of lignocellulose degrading enzymes than mkPC9 and dkN001 when cultured using wood as a carbon source. Moreover, dkN001 was able to secrete more plant cell wall decomposing enzymes, correlating with their superior capacity to grow on lignocellulosic substrates. Furthermore, the three strains were cultured in three different media using with glucose, wood or both (glucose and wood) as a carbon source. As expected, we identify a higher number of lignocellulose degrading enzymes in wood-containing media, especially glycosyl-hydrolases, carbohydrate esterases and polysaccharide lyases. Fungal lignocellulose degradation is the result of the synergistic action of several enzymes. These thesis improve our overall understanding of plant biomass degradation as a step to achieve the goal of using biomass as a sustainable source of energy to support future needs.

El objetivo de esta tesis es estudiar las proteínas secretadas por el hongo basidiomiceto de la podredumbre blanca Pleurotus ostreatus, un excelente comestible ampliamente cultivado por todo el mundo, con tres propósitos principales: determinar el conjunto de proteínas secretadas en diferentes condiciones nutricionales, determinar el efecto de las cepas monocarióticas o dicarióticas en el secretoma, y explorar la relación entre el transcriptoma de las proteínas secretadas y su presencia en diferentes medios de cultivo. En el primer capítulo de esta tesis, revisaremos varios análisis de secretomas de basidiomicetos comparando los resultados obtenidos utilizando diferentes técnicas analíticas y discutiendo algunos ejemplos representativos. Prestaremos especial atención a las enzimas lignocelulolíticas secretadas y a los diferentes estilos de vida fúngicos. Este capítulo es una versión actualizada del artículo titulado “Comparative analysis of secretomes in basidiomycete fungi” que publicamos en Journal of Proteomics en 2014 como una revisión. En este capítulo, concluimos que una combinación de técnicas genómicas, transcriptómicas y proteómicas sigue siendo el mejor enfoque para analizar secretomas fúngicos, y para permitir la identificación de patrones de secreción asociados a los diferentes estilos de vida. En el tercer capítulo, hemos seleccionado dos genomas monocarióticos de P. ostreatus para identificar bioinformáticamente los genes que codifican las proteínas dirigidas a la secreción. El estudio se realizó utilizando los dos protoclones monocarióticos (mkPC9 y mkPC15) cuyos genomas habían sido previamente secuenciados y anotados en un proyecto colaborativo llevado a cabo con el Joint Genome Institute. Estos dos protoclones contienen los dos núcleos presentes en las cepas dicarióticas de la cepa comercial dkN001. Los resultados obtenidos mostraron que, sorprendentemente, ambas cepas difieren en sus capacidades genómicas para degradar lignocelulosa. mkPC9 tiene menos genes CAZy anotados, especialmente glycosil hidrolasas (GH). Sin embargo, crece mejor que mkPC15 sobre sustratos lignocelulósicos y tiene una mayor capacidad de secreción enzimática cuando crece en presencia de madera. La transcripción de los genes codificantes para proteínas secretables fue estudiada por RNAseq, y se observó que mientras el número de genes clasificados para cada función es similar en las dos cepas, los correspondientes perfiles transcriptómicos son diferentes entre ellos y también diferentes según las condiciones de cultivo. La actividad transcripcional se concentra en pocos genes por función, y se observó que las glicosil hidrolasas y las proteínas sin una clasificación funcional tienen una mayor importancia de lo que se infería analizando su número. Estos resultados ponen de relieve la importancia de agregar datos adicionales a las listas de genes producidos por el análisis genómico para obtener una imagen más precisa del proceso biológico en estudio. P. ostreatus secreta una gran variedad de enzimas degradadoras de lignocelulosa cuando se cultiva en presencia de madera. Más del 20% de las proteínas secretadas carece de una función enzimática conocida. El análisis de transcriptoma subraya la importancia de estas proteínas, confirmada además por la proteómica. Usando la predicción de la estructura de las proteínas, pudimos inferir el posible papel de varias proteínas, incluyendo una xilanasa y un AA10 LPMO. Este capítulo es una versión del manuscrito titulado “Comparative and transcriptional analysis of the predicted secretome in the lignocellulose‐degrading basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus” publicado en Environmental Microbiology en 2016. Finalmente, en el cuarto capítulo, se utilizaron análisis de espectrometría de masas para confirmar la presencia de estas enzimas actuando sobre los sustratos lignocelulósicos. Las tres cepas se cultivaron en tres medios diferentes usando glucosa, madera o ambos (glucosa y madera) como fuente de carbono. Como era de esperar, identificamos un mayor número de enzimas de degradación de lignocelulosa en medios que contienen madera, especialmente glicosil hidrolasas, carbohidrato esterasas y polisacárido liasas. Además, observamos que las tres cepas se comportan de manera diferente. mkPC15 mostró una producción más débil de enzimas de degradación de lignocelulosa que mkPC9 y dkN001 cuando se cultivó usando madera como fuente de carbono. La cepa dkN001 fue capaz de secretar más enzimas de descomposición de la pared celular de las plantas, como corresponde a su mayor capacidad para crecer en sustratos lignocelulósicos. La degradación fúngica de la lignocelulosa es el resultado de la acción sinérgica de varias enzimas. Esta tesis mejora nuestra comprensión general de la degradación de la biomasa vegetal para lograr el objetivo de utilizar la biomasa como una fuente sostenible de energía para el futuro.