Physiological action of herbicides inhibiting amino acid biosynthesis and their sustainable mixtures in Amaranthus palmeri sensitive and resistant to glyphosate

Abstract

Durante el siglo pasado, la producción agrícola se ha ido incrementando en todo el mundo gracias a la mejora en sus técnicas de manejo. Una de las herramientas más poderosas para alcanzar ese incremento en la producción fueron los herbicidas, los cuales eliminan las malas hierbas que compiten con los cultivos por los recursos naturales. Sin embargo, el uso inapropiado de los herbicidas ha desencadenado la aparición de resistencias en malas hierbas, un problema global para la agricultura que se ha ido incrementando durante los últimos 30 años. El glifosato es el herbicida más usado en todo el mundo debido a su efectividad como herbicida total, y sobre todo desde la aparición de cultivos genéticamente modificados resistentes a este herbicida. La diana del glifosato es la enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), en la ruta biosintética de los aminoácidos aromáticos (AAA). Una de las peores malas hierbas que se ha descrito como resistente al glifosato es Amaranthus palmeri, cuyo mecanismo de resistencia es la amplificación génica de la enzima EPSPS, lo que conlleva una sobreexpresión de ésta enzima diana del glifosato. El objetivo general de este trabajo fue evaluar los efectos fisiológicos desencadenados por el glifosato que llevan a los individuos de las poblaciones sensible (GS) y resistente (GR) a la muerte, centrándolo fundamentalmente en las consecuencias del tratamiento con glifosato sobre la ruta de los AAA y la ruta de los aminoácidos ramificados (BCAA). Además, se aplicarion mezclas de glifosato y el inhibidor de la AHAS imazamox (inhibidor de la ruta de los BCAA) para profundizar en la regulación de ambas rutas biosintéticas de aminoácidos y su posible regulación cruzada, además de para confirmar o rechazar la posibilidad del empleo de las mezclas como una alternativa a la aplicación del glifosato en solitario. Para estas metas, la respuesta al glifosato de una población sensible (GS) y otra resistente (GR) de A. palmeri obtenidas en Carolina del Norte, fueron comparada a los niveles molecular y bioquímico. En este trabajo se ha confirmado la correlación entre la sobreexpresión génica, el contenido proteico y el nivel de actividad de la enzima EPSPS con el nivel de resistencia de la población GR de A. palmeri. Los altos niveles de variación en el número de copias génicas (CNV) de la enzima EPSPS no tuvieron efectos importantes en los parámetros estudiados: la expresión de las rutas de biosíntesis de los AAA y de los BCAA, el contenido en aminoácidos libres y el contenido en carbohidratos fue similar para ambas poblaciones en condiciones de control. Esto sugiere que la CNV de la enzima EPSPS no tuvo un efecto pleiotrópico importante en la fisiología de las plantas resistentes. La acumulación de siquimato producida tras el tratamiento con glifosato en la población GS (pero no en la GR) indicó que la afección producida en la población sensible fue mayor. Los incrementos en los niveles de aminoácidos totales libres y aromáticos, menores en la población GR que en la GS, confirmaron que el daño producido en la población sensible fue mayor. Se estudió la respuesta transcripcional de las poblaciones GS y GR al tratamiento con glifosato, y se detectó una inducción general de la expresión de las enzimas de la ruta de los AAA. Se encontraron incrementos muy grandes en los niveles de tránscritos de la enzima Antranilato sintasa mientras que los niveles de tránscritos de la enzima Corismato mutasa no se incrementaron, lo que sugiere un flujo preferencial de carbono hacia la formación de triptófano en vez de tirosina o fenilalanina tras el punto regulatorio de la formación de corismato en presencia del herbicida. La ausencia de respuesta al tratamiento con glifosato en la expresión génica de la ruta biosintética de los BCAA, y de la ruta de los AAA al imazamox, sugirió que no existe regulación cruzada entre las rutas biosintéticas de los AAA y de los BCAA a nivel transcripcional, a pesar de su estrecha relación. Por último, las interacciones entre las mezclas de dos dosis diferentes de glifosato y una de imazamox se estudiaron en A. palmeri. Se detectó un efecto antagonista general en los principales parámetros fisiológicos: siquimato, aminoácidos y niveles de carbohidratos, porque los efectos detectados con las mezclas fueron en su mayoría menores que la adición de los efectos individuales de cada herbicida. Este antagonismo fisiológico general sugiere que al aplicar la mezcla de glifosato e imazamox en campo, las dosis recomendadas no pueden ser disminuidas. Resumiendo, esta tesis describe nuevos aspectos fisiológicos en la caracterización de la población de Carolina del Norte resistente al glifosato y desentraña el modo de acción del glifosato en plantas sensibles y resistentes cuando éste es aplicado individualmente o combinado con imazamox.

Over the last century, the production of crops worldwide has substantially increased due to the improvement in crop varieties and in management techniques. One of the most powerful tools used to achieve this increase was herbicides, which eliminates the weeds that compete with the crops for natural resources. However, the sustained use of herbicides has triggered the appearance of resistance in weeds, which is a global agricultural problem that has been exponentially increasing over the last 30 years. Glyphosate is the most highly used herbicide worldwide due to its effectiveness and due to genetically modified crops that are resistant to this herbicide. The target site of glyphosate is 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), an enzyme in the biosynthetic pathway of the aromatic amino acids (AAAs). One of the worst weeds reported to have resistant populations to glyphosate is Amaranthus palmeri, whose resistance mechanism involves EPSPS gene amplification, which leads to an overexpression of the enzyme target of glyphosate. The general objective of this work was to evaluate the physiological effects triggered by glyphosate that resulted in plant mortality in sensitive (GS) and resistant (GR) populations, focusing mainly on the consequences of glyphosate treatment in the AAA pathway and the branched-chain amino acid (BCAA) pathway. In addition, mixtures of glyphosate and the AHAS-inhibitor imazamox (an inhibitor of the BCAA pathway) were applied to obtain new insights into the regulation of both amino acid biosynthetic pathways and the possible cross-regulations and to confirm or reject the possibility of the employment of their mixture as an alternative to the application of glyphosate alone. To this end, the response to glyphosate of one glyphosate-sensitive (GS) and one glyphosate-resistant (GR) population of A. palmeri from North Carolina were compared at the molecular and biochemical levels. In this work, a correlation between EPSPS overexpression, EPSPS protein content and EPSPS activity and the level of resistance of the A. palmeri GR population was confirmed. A high copy number variation (CNV) of EPSPS had no major pleiotropic effect on the studied parameters; the AAA and BCAA pathway expression, free amino acid profiles and carbohydrate contents were similar for both populations in the untreated plants. This suggests that the CNV of EPSPS had no major pleiotropic effects on the physiology of the resistant plants. The significant increase in shikimate content with increasing doses of glyphosate in the GS population (but not in the GR population) suggests that the damage produced in the sensitive population was higher. The lower general increase in total free and aromatic amino acid (AAA) content in the GR population than in the GS population confirmed that the GS population damage was higher. The transcriptional response of the GS and GR populations to glyphosate treatment was studied, and a general induction of AAA pathway enzyme expression was identified. Very high increases in the Anthranilate synthase enzyme transcript levels were measured, while Chorismate mutase transcripts were not increased, suggesting a preferential flux of carbon towards the formation of tryptophan instead of tyrosine or phenylalanine after the regulatory point of chorismate formation. The absence of a response of BCAA gene expression to glyphosate treatment and the AAA gene expression after imazamox treatment suggests that no cross regulation exists between the AAA and BCAA pathways at the transcriptional level, despite their close relationship. Finally, interactions between mixtures of two different doses of glyphosate and one of imazamox were tested on A. palmeri. A general antagonistic effect was detected in the main physiological markers (shikimate, amino acid and carbohydrate levels) because effects that were detected after the application of the mixtures were mostly lower than the effects seen when applying the individual compounds. This general physiological antagonism suggests that the doses cannot be lowered in the mixtures of glyphosate and imazamox to be applied in the field. To summarize, this study describes new physiological insights into the characterization of the glyphosate-resistant weed population of North Carolina and unravels the mode of action of glyphosate on sensitive and resistant plants when applied alone or in combination with imazamox.