Implicación del metabolismo bacteriano en la interacción de Haemophilus influenzae con el sistema respiratorio humano: bases moleculares y explotación terapéutica
Fecha
2022Autor
Versión
Acceso abierto / Sarbide irekia
Tipo
Tesis doctoral / Doktoretza tesia
Identificador del proyecto
Impacto
|
10.48035/Tesis/2454/42510
Resumen
Este trabajo de Tesis Doctoral aborda el papel de tres aspectos del metabolismo bacteriano
(síntesis de purinas, catabolismo de glucosa, síntesis de ácidos grasos) en la interacción entre el
patógeno Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano. Mediante
análisis de expresión génica global, inactivación génica y caracterización fenotípica in vitro e in vivo,
m ...
[++]
Este trabajo de Tesis Doctoral aborda el papel de tres aspectos del metabolismo bacteriano
(síntesis de purinas, catabolismo de glucosa, síntesis de ácidos grasos) en la interacción entre el
patógeno Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano. Mediante
análisis de expresión génica global, inactivación génica y caracterización fenotípica in vitro e in vivo,
modelado computacional, química médica, y evaluación antimicrobiana a nivel preclínico,
estudiamos los perfiles transcripcionales de patógeno y hospedador durante la infección respiratoria
(Capítulo 2), la contribución del catabolismo de glucosa en la patogénesis de H.
influenzae (Capítulo 3), y el potencial antimicrobiano de la inhibición de la ruta de biosíntesis de
ácidos grasos de esta bacteria (Capítulo 4).
H. influenzae fue el primer organismo de vida libre cuyo genoma completo fue secuenciado,
haciéndolo pionero en el desarrollo y empleo de técnicas -ómicas. El Capítulo 1 de este trabajo ha
revisado la contribución de abordajes -ómicos incluyendo genómica, transcriptómica, proteómica y
metabolómica, al estudio de la interacción entre HiNT y el sistema respiratorio humano.
En el Capítulo 2 de este trabajo realizamos un estudio multi-ómico in vivo, consistente en la
utilización de RNA-seq dual y Tn-seq durante el proceso de infección respiratoria murina por HiNT.
El perfil de expresión génica diferencial entre bacterias cultivadas in vitro y bacterias recuperadas de
lavado broncoalveolar murino mostró la sobre-expresión de genes que codifican enzimas implicadas
en la síntesis de purinas y aminoácidos, así como de genes que codifican parte de la maquinaria de
competencia natural de la bacteria.
El aumento de los niveles de glucosa en las vías respiratorias de pacientes que sufren
enfermedades respiratorias crónicas facilita la proliferación de patógenos que metabolizan este
azúcar. HiNT cataboliza glucosa mediante una fermentación asistida por respiración que conlleva la
excreción de acetato, formato y succinato. En el Capítulo 3 de este trabajo, diseñamos, generamos
y caracterizamos un panel de cepas mutantes que no producen acetato, formato o succinato mediante
la inactivación de los genes ackA, pflA y frdA, respectivamente. La inactivación de ackA limitó la
producción de acetato y el crecimiento bacteriano, y estimuló tanto la producción de lactato en
anaerobiosis como la atenuación bacteriana in vivo. El acetato excretado estimuló la expresión de
genes pro-inflamatorios en células de epitelio respiratorio en cultivo, lo que sugiere que el
catabolismo de glucosa contribuye no sólo al crecimiento de HiNT sino también a la
inmunomodulación del sistema respiratorio humano.
La resistencia de H. influenzae a antibióticos β-lactámicos ha llevado a su inclusión en la lista de
patógenos bacterianos para los que la OMS considera prioritaria la búsqueda y desarrollo de nuevos
antimicrobianos. En el Capítulo 4 de este trabajo, desarrollamos y validamos un modelo metabólico
de H. influenzae a escala genómica, que utilizamos como herramienta de escrutinio in silico de genes
esenciales de este patógeno, para su explotación como dianas terapéuticas. Este modelo predijo la esencialidad de un gran número de genes implicados en la síntesis de lípidos. Nos centramos en la
enzima FabH, que cataliza la condensación descarboxilativa de malonil-ACP y acil-CoA en la
iniciación de la biosíntesis de ácidos grasos. Nuestro modelado computacional mostró la idoneidad
de la interacción de la molécula ácido 1- (5- (2-fluoro-5- (hidroximetil) fenil) piridin-2-il) piperidin-
4-acético y la proteína FabH. Este inhibidor redujo la viabilidad bacteriana de forma dosisdependiente.
El efecto inhibitorio observado fue variable entre aislados clínicos portadores de
distintas variantes alélicas del gen fabH, e independiente de su expresión. El inhibidor empleado no
generó sinergias, no favoreció el desarrollo de resistencias, y no alteró la dinámica de infección
epitelial por HiNT, mostrado además un efecto protector frente a la infección por HiNT in vivo.
En conjunto, este trabajo de Tesis Doctoral proporciona conocimiento nuevo sobre el papel del
metabolismo bacteriano en la interacción HiNT-sistema respiratorio humano, que esperamos sea de
utilidad en el desarrollo de estrategias anti-infectivas que mejoren el manejo clínico de las
enfermedades infecciosas asociadas a este patógeno. [--]
This PhD Thesis work addresses the role of three aspects of bacterial metabolism (purine
synthesis, glucose catabolism, fatty acid synthesis) in the interaction between nontypeable
Haemophilus influenzae (NTHi) and the human airways. Global gene expression analysis, gene
inactivation and phenotypic characterization in vitro and in vivo, computational modeling, medical
chemistry, and antimicro ...
[++]
This PhD Thesis work addresses the role of three aspects of bacterial metabolism (purine
synthesis, glucose catabolism, fatty acid synthesis) in the interaction between nontypeable
Haemophilus influenzae (NTHi) and the human airways. Global gene expression analysis, gene
inactivation and phenotypic characterization in vitro and in vivo, computational modeling, medical
chemistry, and antimicrobial evaluation at the preclinical level, led us to study pathogen and host
transcriptional profiles during respiratory infection (Chapter 2), the contribution of glucose
catabolism to H. influenzae pathogenesis (Chapter 3), and the antimicrobial potential of inhibiting
this bacterial fatty acid biosynthesis pathway (Chapter 4).
H. influenzae was the first free-living organism whose genome was fully sequenced, thus
pioneering in the development and use of -omics techniques. Chapter 1 of this work reviewed the
contribution of -omic approaches including genomics, transcriptomics, proteomics and
metabolomics, to the study of this host-pathogen interplay.
In Chapter 2, we carried out an in vivo multi-omic study, using dual RNA-seq and Tn-seq during
murine respiratory infection by NTHi. Differential gene expression profiling of bacteria grown in
vitro compared to those recovered from murine bronchoalveolar lavage fluid samples showed overexpression
of genes that encode enzymes involved in purine and amino acids synthesis, as well as of
genes encoding part of the bacterial natural competence machinery.
The increase of glucose levels in the respiratory tract of patients suffering chronic respiratory
diseases facilitates the proliferation of pathogens able to metabolize this sugar. NTHi catabolizes
glucose through respiration-assisted fermentation involving the excretion of acetate, formate, and
succinate. In Chapter 3 of this work, we designed, generated, and characterized a panel of mutant
strains that did not produce acetate, formate, or succinate by inactivating the ackA, pflA, and frdA
genes, respectively. Inactivation of the ackA gene limited acetate production and bacterial growth,
and stimulated both anaerobic lactate production and bacterial attenuation in vivo. The excreted
acetate stimulated the expression of pro-inflammatory genes by cultured respiratory epithelial cells,
which suggests that glucose catabolism contributes not only to the growth of NTHi but also to
immunomodulation within the human respiratory system.
The H. influenzae resistance to β-lactam antibiotics led to its inclusion in the list of bacterial
pathogens for which the WHO considers a priority the search and development of new
antimicrobials. In Chapter 4 of this work, we developed and validated a H. influenzae genome-scale
metabolic model, which we used as an in silico screening tool to identify bacterial essential genes
suitable as therapeutic targets. This model predicted the essentiality of a large number of genes
involved in lipid synthesis. We focused on the enzyme FabH, which catalyzes the decarboxylative
condensation of malonyl-ACP and acyl-CoA in the initiation of fatty acid biosynthesis.
Computational modeling showed the suitability of the interaction of the chemical inhibitor 1- (5- (2-Fluoro-5- (hydroxymethyl) phenyl) pyridin-2-yl) piperidine-4-acetic acid with FabH. Likewise, this
inhibitor reduced bacterial viability in a dose-dependent manner. The inhibitory effect observed was
variable among clinical isolates carrying different allelic variants of the fabH gene, and independent
of this gene expression. The inhibitor did not generate synergies, did not favor the development of
resistance, and did not alter the dynamics of epithelial infection by NTHi. Notably, this chemical
inhibitor showed a protective effect against NTHi infection in vivo.
Altogether, this PhD Thesis work provides novel knowledge on the role of bacterial metabolism
in the NTHi-human respiratory system interplay, intended to be useful in the development of antiinfective
strategies that will improve the clinical management of infectious diseases associated to
this pathogen. [--]
Materias
Haemophilus influenzae,
Metabolismo bacteriano,
Sistema respiratorio
Notas
La tutora de la tesis es Inmaculada Farrán Blanch
Programa de doctorado
Versión del editor
Entidades Financiadoras
Gobierno de Navarra, convocatoria de ayudas “Doctorados industriales 2018-2020”, referencia 0011-1408-2017-000000. Contrato con cargo a proyecto Retos Investigación de la Agencia Estatal de Investigación, referencia RTI2018-096369-B-I00.