Study of the stability of a plant-based fermented product and its effect in a murine model of type II diabetes

Abstract

Esta tesis se basa en tres publicaciones científicas. En primer lugar, analizamos el efecto de la suplementación con Probisan® en la rata Zucker Diabetic Fatty, un modelo animal experimental de diabetes tipo 2, en un estudio que duró 31 semanas (Estudio 1). Al final del estudio observamos que la administración de Probisan® en este modelo animal no previno el desarrollo de diabetes tipo 2 aunque si retrasó el inicio de la enfermedad. Además de ello, pudimos confirmar que la suplementación con Probisan® fue favorable porque disminuyó las complicaciones y molestias derivadas de la diabetes, mejorando la salud de los animales suplementados e incrementando su esperanza de vida. Presuponemos que dicha protección se obtuvo mediante la modulación de la microbiota gastrointestinal. En cualquier caso, nuestro estudio presenta ciertas limitaciones y se requiere de más estudios para esclarecer el tema. En segundo lugar, actualizamos el conocimiento sobre el papel de la microbiota gastrointestinal en la patogénesis de la diabetes tipo 1, otra forma de diabetes mellitus (Estudio 2). Se trata de un tema de suma importancia ya que la diabetes tipo 1 es una enfermedad incurable y existe una gran heterogeneidad en la respuesta de los pacientes frente a los tratamientos, lo que dificulta el desarrollo de tratamientos efectivos para la mayoría de enfermos. Para ello realizamos una revisión narrativa sobre las terapias emergentes para tratar la enfermedad. Particularmente, nos centramos en aquellas estrategias basadas en la inmunoterapia, y en una de las secciones del trabajo profundizamos sobre el papel de la microbiota como nuevo enfoque para tratar la enfermedad. Este estudio nos aportó una perspectiva más amplia para comprender mejor la implicación de los microorganismos intestinales en la diabetes mellitus. Además, nos permitió explorar las posibles estrategias terapéuticas para abordar la diabetes tipo 1 mediante cambios en la ecología microbiana intestinal, tanto a nivel estructural como funcional. Por último, con el objetivo de conocer mejor Probisan® y su comportamiento en el tiempo, quisimos evaluar los cambios que tienen lugar en el producto durante su almacenamiento (Estudio 3). Para analizar las propiedades fisicoquímicas y microbiológicas del producto a lo largo del tiempo realizamos un estudio de campo en el cual Probisan® estuvo expuesto a condiciones de almacenamiento simuladas durante su vida útil (1 año). Para ello se prepararon pequeños sacos con Probisan® (150 g de producto) que fueron almacenados en ocho condiciones diferentes [cuatro temperaturas de almacenamiento (-20 ºC, 4 ºC, 22 ºC and 37 ºC) y dos tipos de envasado (envasado normal y envasado al vacío)]. El pH, la humedad y los recuentos de bacterias totales, bacterias lácticas y levaduras fueron determinados en cada tiempo de muestreo (0, 1, 3, 6 y 12 meses de almacenamiento). Estábamos particularmente interesados en el estudio de la viabilidad microbiana ya que hipotetizamos que los microorganismos vivos podrían jugar un papel clave en los efectos beneficiosos de Probisan®. Al final del estudio pudimos concluir que la carga microbiana de Probisan® se ve afectada negativamente en todas las condiciones estudiadas, y que dicho efecto se intensifica con el tiempo. Nuestros resultados revelaron que, de acuerdo con nuestra hipótesis de partida, el almacenamiento a baja temperatura (-20 ºC y 4 ºC) protege mejor la viabilidad de los microorganismos en Probisan® en comparación con el almacenamiento a temperatura ambiente (22 ºC) o alta temperatura (37 ºC). Por otro lado, no encontramos diferencias importantes entre las dos formas de envasado en los parámetros de estudio, descartándose por tanto el envasado al vacío como posible estrategia para preservar la carga de microorganismos vivos en Probisan®. No obstante, futuros estudios podrían valorar otras formas alternativas de envasado.

This thesis is based on three scientific publications. Firstly, we tested the effect of Probisan® on the Zucker Diabetic Fatty rat, an experimental animal model of type 2 diabetes, for 31 weeks (Study 1). At the end of the study we concluded that the administration of Probisan® in this animal model could not prevent the development of type 2 diabetes, however, it delayed the disease onset. In addition, we were able to confirm that Probisan® supplementation was favorable and alleviated complications and discomfort associated with diabetes, improving the health of the supplemented animals and increasing their life expectancy. We hypothesize that such protection was obtained through the modulation of the gastrointestinal microbiota. In any case, our study has certain limitations and more research is required to clarify this issue. Secondly, we update the knowledge on the role of the gastrointestinal microbiota in the pathogenesis of autoimmune type 1 diabetes, another form of diabetes mellitus (Study 2). It is an extremely important topic since type 1 diabetes is an incurable disease and there is great heterogeneity in the response of patients to treatments, making it difficult to develop effective treatments for most patients. To do this, we conducted a narrative review of emerging therapies to treat the disease. In particular, we focus on those strategies based on immunotherapy, and in a specific section we delve into the role of the microbiota as a new approach to treat the disease. This study gave us a broader perspective to better understand the involvement of gut microbes in diabetes mellitus. Furthermore, it allowed us to explore possible therapeutic strategies to address type 1 diabetes through changes in the intestinal microbial ecology, both structurally and functionally. Lastly, in order to better understand Probisan® and its behaviour over time, we aimed to evaluate the changes that take place in the product during its storage (Study 3). To analyse the physicochemical and microbiological properties of the product over time, we conducted a field study in which Probisan® was exposed to simulated storage conditions during its shelf life (1 year). For this, small sacks were prepared with Probisan® (150 g of product) that were stored in eight storage conditions [four storage temperatures (- 20 ºC, 4 ºC, and 37 ºC) and two types of packaging (normal packaging and vacuum packaging)]. The pH, moisture content, and counts of total bacteria, lactic bacteria, and yeast were determined at each sampling time (0, 1, 3, 6, and 12 months of storage). We were particularly interested in the study of microbial viability as we speculated that alive microorganisms could play a key role in the beneficial effects of Probisan®. At the end of the study we were able to conclude that the microbial load of Probisan® is negatively affected in all the conditions studied, and this effect intensifies over time. Our results revealed that, in good agreement with our starting hypothesis, storage at low temperature (- 20 ºC and 4 ºC) protects better the viability of microorganisms in Probisan® compared to storage at room temperature (22 ºC) or high temperature (37 ºC). On the other hand, we did not find substantial differences between the packaging modes in the measured parameters, and vacuum packaging was ruled out as a possible strategy to preserve the load of alive microorganisms in Probisan®. Notwithstanding, alternative packaging approaches remain to be investigated.