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Diseño de nuevos productos postbióticos para su aplicación en la acuicultura de trucha arcoíris

El uso de los postbióticos como herramientas de control biológico se fundamenta en la utilización de los productos metabólicos derivados del cultivo controlado de los microorganismos. Estos postbióticos pueden ser aplicados para mejorar la salud de los animales que lo consumen. Suponiendo una opción asequible, segura y natural que promueva el bienestar animal por su fácil administración, particularmente en acuicultura. En este contexto, esta tesis pretende desarrollar un producto postbiótico innovador que beneficie a la industria acuícola y mejore la salud de la trucha arcoíris, abordando tanto la selección de microorganismos, la producción de postbióticos y la evaluación de eficacia de producto en condiciones in vivo. Por lo cual, se propusieron los siguientes objetivos: (1) Seleccionar aislados bacterianos obtenidos de peces en función de su capacidad para inhibir los patógenos Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida y Yersinia ruckeri para el diseño de un producto postbióticos; (2) Estandarizar el proceso de fabricación del producto postbiótico a escala de laboratorio, evaluando cambios en las características del producto bajo diferentes diseños experimentales; (3) Estudiar la efectividad del producto en experimentos in vivo, analizando el impacto de la administración de pienso suplementado con postbióticos en la salud de trucha arcoíris; (4) Determinar el efecto del producto postbiótico en la resistencia a las enfermedades yersiniosis y forunculosis a través de modelos de infección experimental. Para el aislamiento de microorganismos candidatos para el diseño del producto postbiótico, se obtuvieron muestras de tejidos de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus). Los microorganismos obtenidos fueron evaluados en experimentos in vitro frente a A. salmonicida subsp. salmonicida y Y. ruckeri seleccionando aquellos con mayor actividad antibacteriana. Posteriormente, estos fueron identificados y empleados para la fabricación de producto postbiótico, con el cual se determinó a través de enfrentamientos por cocultivo y ensayo de microdiluciones si estos conservan la actividad antibacterial previamente reportada. Se seleccionaron dos bacterias, con las cuales se diseñó el proceso de fabricación, perfilando características como la supervivencia de los microorganismos en diferentes pH y porcentaje de sales biliares de trucha arcoíris, su capacidad hidrofóbica y potencial enzimático. Así mismo, el producto postbiótico fue fabricado bajo diferentes condiciones experimentales, determinando la sinergia que existe entre ambos microorganismos, la influencia del tiempo de incubación previo a la inactivación y la influencia del medio de cultivo empleado en la actividad antimicrobiana. Además, el producto fue sometido a diferentes temperaturas y enzimas proteolíticas determinando su termoestabilidad y el aporte de las fracciones proteicas en la actividad antimicrobiana. Se realizó una experiencia in vivo donde se alimentó a trucha arcoíris con pienso suplementado con postbiótico al 0.5%, y con pienso sin suplementar, tomando muestras en puntos específicos del período de suplementación. Para el estudiar el efecto inmunomodulador, se tomaron muestras de riñón cefálico y se estudiaron cinco citoquinas a través de real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Para el estudio de cambios en la microbiota intestinal se tomaron muestras de mucus intestinal, que fueron procesadas en medios de cultivo selectivos para evaluar cambios en las concentraciones de bacterias ácido-lácticas y aeróbicos totales. Al finalizar el estudio los peces fueron pesados para determinar cambios en el peso final. Finalmente, los animales que consumieron el pienso suplementado y control fueron sometidos a infecciones experimentales con los patógenos A. salmonicida subsp. salmonicida y Y. ruckeri, para poder determinar cambios en la supervivencia y evaluando la contribución del pienso suplementado a la mejora en la resistencia de los animales a las enfermedades de yersiniosis y forunculosis. Se aislaron 369 microorganismos de las muestras iniciales, de los cuales se identificaron 12. Cuatro pertenecían a Pediococcus acidilactici, siete a W. cibaria, y uno a Weissella paramesenteroides. Se fabricaron postbióticos utilizando estos aislados y se determinó que dos aislados de W. cibaria exhibían la mayor actividad antibacteriana contra los patógenos de interés. Se confirmó que las proteínas en el producto postbiótico eran principalmente responsables de su actividad antibacteriana. A pesar de la pérdida parcial de eficacia durante el proceso de fabricación en medios de cultivo vegetal, cocultivo y exposición al calor, la actividad antibacteriana seguía siendo significativa. La administración de pienso suplementado con postbiótico aumentó las concentraciones de bacterias acidolácticas en el intestino de la trucha arcoíris. Además, se observó una modulación en la expresión de citoquinas proinflamatorias y una mejora en la supervivencia frente a Y. ruckeri y A. salmonicida subsp. salmonicida. Es necesario seguir avanzando en la investigación de alternativas al uso de antibióticos, especialmente enfocado en el desarrollo de postbióticos aplicables en la acuicultura y otras áreas de producción animal. Estas innovadoras opciones buscan no solo reemplazar los antibióticos, sino también erradicar su uso en la cría de animales, con el objetivo de prevenir la propagación de genes de resistencia en los animales, su entorno y, en última instancia, en los consumidores.

The use of postbiotics as biological control tools is based on utilizing metabolic products derived from the controlled culture of microorganisms. These postbiotics can enhance the health of the animals that consume them. Representing an affordable, safe, and natural option that promotes animal well-being due to its easy administration, particularly in aquaculture. In this context, this thesis aims to develop an innovative postbiotic product that benefits the aquaculture industry and improves the health of rainbow trout, addressing the selection of microorganisms, postbiotic production, and product efficacy evaluation under in vivo conditions. Therefore, the following objectives were proposed: (1) to select bacterial isolates obtained from fish based on their ability to inhibit the pathogens Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida and Yersinia ruckeri for the design of the postbiotic product; (2) to standardize of the manufacturing process of the postbiotic product at a laboratory scale, assessing changes in the product's characteristics under different experimental conditions; (3) to investigate the product's effectiveness in vivo , analyzing the impact of administering feed supplemented with postbiotics on the health of rainbow trout; (4) to determine the effect of the postbiotic product on resistance to yersiniosis and furunculosis through experimental infection models. To isolate candidate microorganisms for the design of the postbiotic product, tissue samples from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and Nile tilapia (Oreochromis niloticus) were collected. The obtained microorganisms were assessed in vitro against A. salmonicida subsp. salmonicida and Y. ruckeri, selecting those with the highest antibacterial activity. Subsequently, these microorganisms were identified and used to produce the postbiotic product. The product's ability to retain the previously reported antibacterial activity was determined through co-culture challenges and microdilution assays. Two bacteria were selected for the postbiotic production process, and their survival in different pH levels and rainbow trout bile salt percentages, hydrophobicity, and enzymatic potential were profiled. Additionally, the postbiotic product was manufactured under different experimental conditions to assess the synergy between the two microorganisms, the influence of incubation time before inactivation, and the impact of the culture medium on antimicrobial activity. The product was also subjected to various temperatures and proteolytic enzymes to determine its thermosensitivity and the contribution of protein fractions to its antimicrobial activity. An in vivo experiment was conducted where rainbow trout were fed with feed supplemented with 0.5% postbiotic and unsupplemented feed, and samples were taken at specific time points during the supplementation period. To study the immunomodulatory effect, samples from the head kidney were collected, and the expression of five cytokines was studied using real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). To study changes in the intestinal microbiota, samples of intestinal mucus were collected and processed in selective culture media to evaluate changes in the concentrations of lactic acid bacteria and total aerobic bacteria. At the end of the study, the fish were weighed to determine changes in final weight. Finally, the animals of the feeding trial were subjected to experimental infections with the pathogens A. salmonicida subsp. salmonicida and Y. ruckeri to determine changes in survival and determine whether the supplemented feed contributes to improving the animals' resistance to yersiniosis and furunculosis. A total of 369 microorganisms were isolated from the initial samples, of which 12 were identified. Four belonged to Pediococcus acidilactici, seven to W. cibaria, and one to Weissella paramesenteroides. Postbiotics were produced using these isolates, and it was determined that two isolates of W. cibaria exhibited the highest antibacterial activity against the target pathogens. It was confirmed that proteins in the postbiotic product were primarily responsible for its antibacterial activity. Despite a partial loss of effectiveness during the manufacturing process in vegetal culture media, co-cultivation, and exposure to heat, the antibacterial activity remained significant. Feeding with postbiotic-supplemented feed increased the concentrations of lactic acid bacteria in the rainbow trout's intestine. Additionally, modulation in the expression of proinflammatory cytokines and an improvement in survival against Y. ruckeri and A. salmonicida subsp. salmonicida were observed. Continued progress in the research of alternatives to antibiotic use is essential, with a particular focus on developing postbiotics applicable in aquaculture and other areas of animal production. These innovative options aim not only to replace antibiotics but also to eradicate their use in animal farming, with the goal of preventing the spread of resistance genes in animals, their environment, and ultimately, consumers.