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Desarrollo de un método de detección de la proteína gigante Ebh en S. aureus

Staphylococcus aureus es una bacteria gram positiva cuyos principales reservorios son los humanos y los animales. No obstante, S. aureus se ha convertido en uno de los principales patógenos en humanos capaz de producir infecciones muy diversas que van desde infecciones cutáneas hasta patologías clínicas graves como bacteriemia, neumonía, sepsis, osteomielitis o endocarditis. En la actualidad, una de las mayores preocupaciones es la gran facilidad que han demostrado estos estafilococos para desarrollar resistencia a muchos antibióticos. Por ello, hay un enorme interés en desarrollar nuevas terapias alternativas efectivas frente a las infecciones causadas por S. aureus. En este estudio nos vamos a centrar en Ebh, una proteína de gran tamaño y cuyo gen representa más del 1% del genoma de esta bacteria. La producción y secreción de esta proteína supone un elevado coste energético para la bacteria por lo que su presencia en la superficie celular debe ser sumamente importante para ella. Hay estudios que han probado la implicación de esta proteína en la adhesión celular, virulencia estafilocócica y, además, su papel es importante tanto en la resistencia a fármacos como en la resistencia al complemento. Al tratarse de una proteína tan grande, no es posible clonar el gen en un plásmido para expresar la proteína controlada o marcarla con una etiqueta. El objetivo de este estudio es añadir una etiqueta 3XFLAG a la proteína Ebh, que nos permita visualizar en qué condiciones se produce, activar o inhibir su presencia jugando con la presencia/ausencia de inductores, analizar cómo se distribuye en la superficie de la bacteria e identificar fenotipos asociados a su ausencia o sobreexpresión. Durante el trabajo hemos conseguido generar cepas recombinantes en los que la proteína Ebh incluye una etiqueta que permite su identificación con anticuerpos específicos para la etiqueta. En las cepas con los promotores inducibles la expresión de Ebh es dependiente de la presencia del inductor, pero en ausencia del inductor se detecta niveles residuales de proteína indicando que ambos promotores tienen escape. El análisis mediante microscopia de fluorescencia confirma la presencia de la proteína en la superficie de la bacteria. El análisis de las cepas que sobreexpresan Ebh respecto a la cepa salvaje que apenas lo expresa o a las cepas en ausencia de inductor, indica que la sobreproducción de Ebh reduce la velocidad de crecimiento mientras que la producción de una forma parcialmente delecionada de la proteína provoca una disminución en el tamaño de la bacteria. Las cepas construidas en este trabajo serán de gran utilidad para seguir investigando la función proteica de Ebh durante el proceso de infección de S. aureus.

Staphylococcus aureus is a gram-positive bacteria whose main reservoirs include humans and animals. However, S. aureus is one of the main human pathogens that causes a wide range of infections. It is a leading cause of bacteremia, pneumonia, sepsis, and infective endocarditis as well as osteoarticular and skin infections. Antibiotic resistance is currently the most serious global threat in Staphylococcal infections. Therefore, there is a huge interest in developing new and effective alternative therapies for these infections. In this study, we will focus on Ebh, a large protein whose gene represents more than 1% of this bacteria genome. Supposedly, production and secretion of this protein would be very expensive energetically, so it seems that its presence on the bacteria must be extremely important. Some studies have revealed the involvement of this protein in cell adhesion, Staphylococcal virulence and, in addition, its role in drug and complement resistance. The large size of Ebh made it impossible to clone the gene into a plasmid to control the expression or tag it. The aim of this project is to insert the 3XFLAG tag to the Ebh protein, that allows us to observe under what conditions it is produced, activate or inhibit its expression depending on the presence/absence of inducers, analyze how it is distributed on the bacterial surface and identify phenotypes associated with its absence or overexpression. Finally, we have generated recombinant S. aureus strains carrying a tag in Ebh protein that allows its identification with tag-specific antibodies. Strains bearing inducible promoters achieve high levels of Ebh expression when are fully induced by the inducer, but residual protein levels are detected in uninduced strains. So, that results suggest that both promoters are leaky. Also, fluorescence microscopy analysis revealed the presence of the protein on the bacterial surface. Other analysis indicates that strains, which overproduce Ebh reduces the growth rate while strains producing a deleted version of the protein causes a decrease in bacterial size. These recombinant strains will be useful in further investigating the function of Ebh protein in order to gain a deeper understanding of its role during the infection process of S. aureus.