Characterisation of Huntington disease in the Spanish population: an epidemiological and molecular study of the HTT gene variability and CAG repeat somatic instability

El objetivo de esta tesis doctoral es describir la enfermedad rara, neurodegenerativa y autosómica dominante, conocida como enfermedad de Huntington (EH) en la población española. Para ello, estudiamos la epidemiología de la enfermedad, las características moleculares del gen de la EH (HTT) y la inestabilidad somática de las repeticiones de CAG, analizando su potencial efecto modificador del fenotipo clínico en portadores de alelos intermedios (AIs). Para el estudio epidemiológico, se identificaron casos con EH a través del Registro de Enfermedades Raras y del centro de Genética Médica de referencia de Navarra, estimándose la tasa de prevalencia con fecha 31 de diciembre de 2017, y las de incidencia y mortalidad, para un período de 27 años (1991-2017). La diversidad genética del gen HTT se analizó mediante el genotipado de SNPs y una secuenciación profunda del exón uno, en dos grandes cohortes nacionales: una muestra de controles poblacionales (n=520) y otra de familias con individuos sintomáticos (n=471), remitidos para diagnóstico genético de EH, incluyendo 331 sujetos índices con EH y 140 portadores de AIs (27-35 CAG repeticiones). También se recogieron los datos clínicos y las historias familiares disponibles, en base a lo cual los portadores de AIs se clasificaron en sintomáticos o controles de la población general. Se estudió la inestabilidad somática en sangre de individuos portadores de alelos de ≥27 CAGs, así como la posible asociación de las expansiones somáticas con la presencia de signos neurocognitivos en portadores de AIs (53 controles y 82 sintomáticos, incluyendo muestras de tejido cerebral de un paciente sintomático, portador de 33 CAGs). La prevalencia de EH en Navarra, en diciembre de 2017, fue de 4,94 (IC del 95%: 3,23, 6,65) por 100.000, con un aumento anual del 6,1% desde 1991 hasta 1999. Las tendencias de incidencia y mortalidad se mantuvieron estables desde 1995-96, con tasas medias anuales por 100.000 de 0,36 (IC del 95%: 0,27, 0,47) y 0,23 (IC del 95%: 0,16, 0,32), respectivamente. Las edades medias de inicio de síntomas y de fallecimiento en individuos EH fueron de 49.6 ± 18.8 y 66.6 ± 17.1 años, respectivamente, con una duración media de la enfermedad de 16.7 ± 8.1 años. El estudio molecular del gen HTT reveló que los alelos de <27 CAGs de la población española tienen una mayor proporción de haplotipos C (40,1%), mientras que el A1 (39,8%) y A2 (31,6%) predominan entre los alelos intermedios y expandidos, respectivamente. Los alelos de ≥50 CAGs están asociados principalmente a los haplotipos A2 (38,9%) y C (32%), también presentes en el 50% y el 21,4%, respectivamente, de familias EH con grandes expansiones intergeneracionales. La deleción de CAACAG en el exón uno del gen HTT se asocia con el haplotipo C y parece correlacionarse con mayores expansiones intergeneracionales y un inicio temprano de los síntomas. El fenotipo de portadores de AIs se caracterizó por signos motores (84%), cognitivos (29%) y/o conductuales (28%), con una edad tardía de comienzo de los síntomas (58.7 ± 18.6 años), sin correlación con la longitud de CAGs. Los AIs presentan expansiones somáticas dependientes del nº de CAG y de la edad, con un 0,4% y un 0,01% de moléculas de ADN que se expanden por cada CAG y año, respectivamente. Los portadores sintomáticos de AIs no presentaban una inestabilidad somática estadísticamente diferente a la de los controles de la población general (p=0,066). Se detectaron expansiones somáticas de +1 y +2 CAGs en el cerebro del paciente con 33 CAGs, presentes con la mayor proporción en el putamen (10.3%) y la menor en el cerebelo (4.8%). En conclusión, las estimaciones epidemiológicas de la EH en nuestra población están dentro del rango de las del sur de Europa y no experimentaron variaciones temporales reales durante el periodo de estudio. Los haplotipos de alelos EH españoles se caracterizan por una alta diversidad genética, posiblemente secundaria a la mezcla con otras poblaciones no caucásicas, con una representación más alta de los haplotipos A2 y C que en la mayoría de poblaciones europeas. Las diferencias en las distribuciones de haplotipos entre los distintos rangos de CAGs apoyan la existencia de distintos mecanismos de expansión germinal, siendo los haplotipos A2 y C los que muestran las mayores expansiones intergeneracionales, posiblemente influenciados por elementos cis específicos, como la deleción CAACAG. Las expansiones somáticas de repeticiones CAG siguen una correlación gradual con la longitud de CAGs, que afecta tanto a los alelos expandidos como a los intermedios, siendo, además, edad y tejido dependientes; pero no parecen ser un factor desencadenante de un fenotipo neurocognitivo asociado en portadores de AIs. Es posible, sin embargo, que algunos AIs del gen HTT, especialmente aquellos cercanos al umbral patológico, con determinadas características de susceptibilidad genética, puedan manifestar un fenotipo neurológico compatible con la EH.

The aim of this doctoral thesis is to study the epidemiology and the genetic background of the rare and autosomal dominant neurodegenerative disorder of Huntington disease (HD) in the Spanish population. We study the patterns of frequency, distribution and magnitude of the disease, the molecular characteristics of the HD gene (HTT) and the somatic instability of the CAG repeat sequence as a potential modifying factor of the clinical phenotype in intermediate alleles (IAs). For the epidemiologic study, HD cases were ascertained through the Rare Disease Registry and the reference Medical Genetics Centre of Navarra; incidence and mortality rates were estimated for a 27-year period (1991-2017) and prevalence was calculated for December 31st, 2017. HTT diversity was examined by SNP genotyping and deep sequencing analysis of exon one, in two large nationwide cohorts: a population-based control sample (n=520), and 471 families with symptomatic individuals referred for HD genetic testing, which included 331 index HD cases and 140 index IA carriers (27-35 CAG repeats). Clinical and family history data were obtained when available and IA carriers were further classified as symptomatic or population control subjects. Somatic instability of the HTT-CAG repeat sequence was studied in blood DNA samples of individuals with ≥27 CAG repeats. We further analysed the potential association of somatic expansions with neurocognitive signs in IA carriers (53 population controls and 82 symptomatic subjects, including brain tissues of a symptomatic 33 CAG allele carrier). The HD prevalence in Navarra, in December 2017, was 4.94 (95% CI: 3.23, 6.65) per 100,000, with an annual 6.1% increase from 1991 to 1999. Incidence and mortality trends remained stable since 1995-96, with mean annual rates per 100,000 of 0.36 (95% CI: 0.27, 0.47) and 0.23 (95% CI: 0.16, 0.32), respectively. The mean age at onset and death of HD patients was 49.6 ± 18.8 and 66.6 ± 17.1 years, respectively, with an average duration of disease of 16.7 ± 8.1 years. The HTT molecular study revealed that Spanish normal alleles (<27 CAGs) are enriched in C haplotypes (40.1%), while A1 (39.8%) and A2 (31.6%) prevail among intermediate and expanded chromosomes, respectively. Alleles of ≥50 CAG repeats are primarily associated with haplotypes A2 (38.9%) and C (32%), which are also present in 50% and 21.4%, respectively, of HD families with large intergenerational expansions. The deletion of CAACAG in HTT exon one is associated with haplotype C and appears to correlate with larger intergenerational expansions and early onset of symptoms. The phenotype of IA carriers was characterised by motor (84%), cognitive (29%) and/or behavioural (28%) signs, with a late age at onset (58.7 ± 18.6 years) that was not inversely correlated with the CAG length. IAs present somatic expansions that are CAG- and agedependent, with 0.4% and 0.01% of DNA molecules expanding by CAG and year, respectively. Somatic instability was not statistically different in symptomatic vs population control IA carriers (p=0.066). Somatic expansions of +1 and +2 CAGs were detected in brain tissues of the individual with 33 CAGs, with the highest ratio in the putamen (10.3% of the DNA molecules) and the lowest in the cerebellum (4.8%). In conclusion, HD epidemiological estimates observed in our population are within the Southern European countries range, and they did not experience true temporary variations over the last decades of post-molecular testing. Spanish HD haplotypes are characterised by a high genetic diversity, potentially admixed with other non-Caucasian populations, with a higher representation of A2 and C haplotypes than most European populations. Differences in haplotype distributions across the CAG length range support differential germline expansion dynamics, with A2 and C showing the largest intergenerational expansions, possibly under the effect of specific cis-elements such as the CAACAG deletion. Somatic CAG expansions follow a gradual CAG correlation, ranging from expanded to intermediate alleles, in an age and tissue-dependent manner, but they do not seem to be a major triggering factor of an associated neurocognitive phenotype in IA carriers. However, it might be posible that some HTT IAs, especially those close to the pathological threshold with a predisposing background, may manifest with an HD-like phenotype.