Selección de genes de referencia para el estudio de expresión génica en glóbulos grasos de la leche

En el presente trabajo se realizó la selección de genes de referencia para su uso en estudios posteriores de expresión génica en glóbulos grasos de la leche de vaca. Para ello, se seleccionaron 8 genes candidatos que han sido empleados como genes de referencia en estudios previos de expresión génica de la glándula mamaria bovina y se determinó su nivel de expresión en diferentes muestras de grasa láctea. Se realizó un diseño de cebadores para los diferentes genes candidatos y se verificó su correcta amplificación por medio de la técnica de retrotranscripción y posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR por sus siglas en inglés). La eficiencia de la reacción de qPCR se analizó por medio de curvas estándar a partir de diluciones seriadas empleando un pool de muestras de cDNA obtenidas a partir del RNA extraído de los glóbulos grasos de la leche de vaca. Se determinó la estabilidad de los genes candidatos midiendo los niveles de expresión del cDNA de forma individual y por duplicado en las muestras seleccionadas. Los resultados mostraron que las eficiencias de amplificación de la reacción de qPCR fueron óptimas (102-109%) para todos los genes, sin embargo, los genes PPIA, ACTB y GAPDH mostraron valores de R2 algo menores al recomendable (>0,98). Además, el resultado global proporcionado por el algoritmo RefFinder, de análisis de estabilidad, determinó que los genes RPS24 y RPLP0 eran los más estables, permitiendo su uso como genes de referencia en estudios de expresión génica en glóbulos grasos de la leche de vaca.

In this work, a selection of reference genes was carried out for subsequent gene expression studies in milk fat globules of lactating cows. Eight genes that have been used as reference genes in other genes expression studies in bovine mammary gland were selected and their expression level in different milk fat samples was determined. A primer design was carried out for the different candidate genes and their correct amplification was verified using the retrotranscription technique and subsequent polymerase chain reaction (RT-qPCR). The efficiency of the qPCR reaction was analyzed by means of standard curves from serial dilutions using a pool of cDNA samples obtained from RNA extracted from the cow’s milk fat globules. The stability of candidate genes was determined by measuring cDNA expression levels individually and in duplicate in selected samples. The results showed that the amplification efficiencies of qPCR reaction were optimal (102-109%) for all candidate genes, however, PPIA, ACTB and GAPDH, showed R2 values slightly lower than recommended (>0.98). In addition, the overall results provided by the RefFinder stability analysis algorithm, determined that the RPS24 and RPLP0 genes were the most stable, allowing their use as reference genes in gene expression studies in cow’s milk fat globules.