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Desarrollo de un sistema "reporter" para la cuantificación del mensajero secundario c-di-GMP en bacterias.

El c-di-GMP es un mensajero secundario bacteriano involucrado en la regulación de numerosos procesos biológicos. Además, ejerce un papel esencial en la regulación de la transición de un modo de vida planctónico a biofilm. Para llevar a cabo su función, el c-di-GMP se une específicamente a moléculas efectoras, que traducen esta señal en una respuesta celular específica. Entre dichos efectores se encuentran proteínas con dominios de unión a c-di-GMP (PilZ), reguladores transcripcionales y riboswitches. Los riboswitches son moléculas de ARN no codificantes. Están localizados, generalmente, en la región 5´UTR de un ARNm y regulan la expresión génica mediante la unión a un ligando (como c-di-GMP). Los niveles de c-di-GMP en el citoplasma de una bacteria son muy bajos y su cuantificación resulta difícil. En este trabajo, se han diseñado tres sistemas “reporter” de los niveles intracelulares de c-di-GMP in vivo de aplicación general. Estos sistemas están basados en la utilización de un riboswitch, capaz de controlar la expresión de genes fusionados al mismo en función de los niveles de c-di-GMP. En dos de estos sistemas, la fusión es con genes “reporter”, así, dependiendo de los niveles intracelulares de c-di-GMP, los niveles de proteína reporter varían de forma inversamente proporcional a la cantidad de c-di-GMP. En el último de los sistemas, el riboswitch está fusionado con lac I y el gen reporter está bajo un promotor reprimible por lac I, controlando así la cantidad de proteína reporter de forma directamente proporcional al nivel de c-di-GMP. Para valorar la utilidad de estos sistemas se han utilizado cepas de Salmonella con diferentes cantidades de c-di-GMP.

Cyclic di-GMP is a bacterial second messenger that regulates a myriad of biological processes and also plays a key role in the regulation of lifestyle changes, including transition from the motile state to biofilms communities. There are many c-di-GMP specific receptors which translate a specific environmental signal into a specific cellular answer, carrying out c-di-GMP functions. These effectors are proteins with c-di-GMP binding domains (PilZ), transcriptional regulators or riboswitches. Riboswitches are noncoding RNA molecules that are located in the 5’UTR region of an mRNA and regulate the expression of downstream genes by ligand binding (like c-di-GMP). Intracellular levels of c-di-GMP in bacteria are very low and their quantification becomes difficult. In this project, three reporter systems for in vivo measurement of intracellular levels of c-di-GMP in bacteria have been designed. These systems are based on the use of a c-di-GMP riboswitch that regulates the expression of a gene fused with it. In two of these systems, the riboswitch is directly fused with reporter genes, hence high levels of c-di-GMP cause a decrease in levels of the reporter proteins. In the third system, the riboswitch is fused with the lac I gene, and the reporter gene is controlled by a promoter repressible by lac I. In this case, the amount of reporter protein is proportional to the c-di-GMP concentration. In order to validate these systems, three different Salmonella strains with diverse levels of c-di-GMP were used.