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Aislamiento y caracterización de exosomas procedentes de líneas celulares: identificación de nuevos biomarcadores para el cáncer de mama

El cáncer de mama triple negativo (TNBC) es el subtipo más agresivo y con el pronóstico más desfavorable. La tasa de supervivencia de las pacientes depende del estadio del tumor al diagnóstico. Actualmente, la detección se realiza mediante mamografía, una herramienta esencial para la detección del cáncer de mama, sin embargo, puede tener limitaciones. Por ello, ha surgido la necesidad de desarrollar y validar nuevos biomarcadores para mejorar la precisión diagnóstica, como la biopsia líquida, una técnica no invasiva que detecta exosomas potencialmente útiles como biomarcadores. Este trabajo de fin de máster se centró en aislar y caracterizar exosomas del medio de cultivo de líneas celulares de cáncer de mama TNBC MDAMB-321 y la línea control 184B5. La técnica convencional para aislar exosomas es la ultracentrifugación, pero debido a sus limitaciones, se han explorado métodos alternativos como las columnas de centrifugación de afinidad de membrana (EE), la precipitación con polímeros (P) y la ultrafiltración (UF). Los resultados muestran que las nuevas técnicas permiten aislar exosomas con una concentración y tamaño adecuado (30-100 nm). Sin embargo, el análisis proteico por espectrometría de masas reveló que la técnica EE es la más óptima para el enriquecimiento de proteínas exosomales. El estudio proteómico comparativo identificó 342 proteínas con expresión diferencial, de las cuales 147 mostraron un aumento en su expresión y 168 una disminución respecto al control. El análisis funcional de las proteínas identificadas mostró un enriquecimiento en genes relacionados con la matriz extracelular. Destacan proteínas consideradas marcadores cruciales de la transición epitelial-mesenquimal (EMT), como VIM, así como COL14A1, una proteína asociada con el TNBC, y más específicamente con el subtipo mesenquimal (MSL). Por lo tanto, la detección de estas proteínas en los exosomas sugiere su uso como biomarcadores no solo del TNBC, sino más específicamente del subtipo MSL.

Triple-negative breast cancer (TNBC) is the most aggressive subtype with the poorest prognosis. Patient survival rates depend on the stage of the tumor at diagnosis. Currently, detection is done through mammography, an essential tool for breast cancer detection, but it can have limitations. Therefore, there is a need to develop and validate new biomarkers to improve diagnostic accuracy, such as liquid biopsy, a non-invasive technique that detects exosomes potentially useful as biomarkers. This master's thesis focused on isolating and characterizing exosomes from the culture medium of TNBC MDA-MB-231 cell lines and the control line 184B5. The conventional technique for isolating exosomes is ultracentrifugation, but due to its limitations, alternative methods have been explored, such as membrane affinity centrifugation columns (EE), polymer precipitation (P), and ultrafiltration (UF). The results show that these new techniques allow exosomes to be isolated with an adequate concentration and size (30-100 nm). However, protein analysis by mass spectrometry revealed that the EE technique is the most optimal for exosomal protein enrichment. The comparative proteomic study identified 342 proteins with differential expression, of which 147 showed an increase in expression and 168 showed a decrease compared to the control. Functional analysis of the identified proteins showed an enrichment in genes related to the extracellular matrix. Notable proteins included crucial markers of epithelial-mesenchymal transition (EMT), such as VIM, and COL14A1, a protein associated with TNBC, and more specifically with the mesenchymal subtype (MSL). Therefore, the detection of these proteins in exosomes suggests their use as biomarkers not only for TNBC but more specifically for the MSL subtype.