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Sobreexpresión del gen L-aspartato oxidasa en plantas de tabaco (nicotina tabacum) mediante transformación plastidial

El tabaco, especialmente la variedad Petite Havana, es la planta superior más utilizada en transformaciones plastidiales. La transformación plastidial es una de las técnicas más empleadas para la sobreexpresión de proteínas en plantas, ya que permite alcanzar altos niveles de expresión y además presenta numerosas ventajas. La flavoproteína L-aspartato oxidasa (LASPO), es la primera enzima que participa en la ruta biosintética de novo de NAD+ en plantas, dentro del cloroplasto. Esta ruta está relacionada con el desarrollo de la planta y su nivel de tolerancia a estrés. Previamente se ha observado que la sobreexpresión de LASPO aumenta el contenido de NAD+ tanto en plantas (Arabidopsis) como en bacterias. Con estos antecedentes, el objetivo de este trabajo fin de grado fue sobreexpresar plastidialmente en tabaco (Nicotiana tabacum, cv. Petite Havana) el gen LASPO. Para ello, se generaron los vectores de transformación con el gen LASPO regulado por tres promotores diferentes (PpsbA, PrrnG10L y ClpP) para intentar obtener plantas transplastómicas con diferentes niveles de expresión del transgén. Para ello se utilizó el método biolístico. La frecuencia de transformación en base al número de regenerantes obtenidos por hoja bombardeada fue muy baja. Tras analizar a nivel molecular los regenerantes mediante PCR, los resultados mostraron que todos los regenerantes eran escapes, es decir, que el casete de transformación no se había recombinado en el plastoma. Sin embargo, muchas de estas líneas resultaron ser resistentes a la espectinomicina, hecho que se comprobó recogiendo semilla y se germinando la siguiente generación en medio con este antibiótico. Esta resistencia podría atribuirse a mutaciones espontáneas en el genoma plastidial.

Tobacco, especially the Petite Havana variety, is the most frequently used higher plant for plastid transformation. Plastid transformation is a powerful technique for the overexpression of proteins in plants, due to the high expression levels that can be achieved. It also has numerous advantages compared to nuclear transformation. The flavoprotein L-aspartate oxidase (LASPO) is the first enzyme involved in the novo biosynthetic pathway of NAD+ in plants, that is localized inside the chloroplast. This pathway is related to plant development and stress tolerance mechanisms. It was previously observed that the overexpression of LASPO leads to enhance NAD+ content in both plants (Arabidopsis) and bacteria. With this background, the aim of this final grade study was to overexpress LASPO gene from the tobacco (Nicotiana tabacum, cv. Petite Havana) chloroplast genome. For this purpose, transformation vectors were generated containing the sequence of LASPO gene under the control of three different promoters (PpsbA, PrrnG10L and ClpP), trying to obtain transplastomic plants with different levels of expression of the transgene. The biolistic method was used for this purpose. The obtained plastid transformation frequency, based on the number of candidates transformants obtained per bombarded leaf, was very low. A molecular analysis using PCR technique showed a lack of recombination of the transformation cassette in all of the potential transformants. However, many of these transformants were shown to be resistant to spectinomycin, after seed germination in a growing medium containing this antibiotic. This behavior could be attributed to spontaneous spectinomycin resistance mutations in the plastid genome.