Tesis doctorales DPA - NES Doktoretza tesiak

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http://hdl.handle.net/2454/14780

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Genetic reductionist approach for studing the two-component signaling system in Staphylococcus aureus
(2014) Villanueva San Martín, Maite; Lasa Uzcudun, Íñigo; Toledo Arana, Alejandro; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Staphylococcus aureus es una bacteria ubicua capaz de colonizar una gran variedad de ambientes. En el hombre, S. aureus coloniza las fosas nasales, piel de las axilas, ingles, garganta o incluso el tracto intestinal. Se calcula que un 20% de las personas adultas son portadores nasales de S. aureus. En determinadas circunstancias, la bacteria es capaz de atravesar la barrera epitelial y alcanzar los órganos internos. Cuando esto ocurre, S. aureus se convierte en un patógeno muy versátil capaz de causar enfermedades muy diversas, que pueden ir desde infecciones leves como forúnculos o abscesos hasta enfermedades graves como endocarditis, osteomielitis, neumonía o síndrome del shock tóxico. El desarrollo de S. aureus en distintos ambientes requiere que la bacteria sea capaz de sensar las condiciones ambientales, transmitir los estímulos al citoplasma y activar los cambios necesarios para adecuar la fisiología a dicho ambiente. El principal mecanismo para sensar y responder a las señales ambientales en bacterias son los sistemas de dos-componentes (TCSs). Los TCSs están formados por un sensor de membrana o histidinekinase (HK) y un regulador de respuesta citoplásmico (RR). En el proceso de activación, el sensor recibe su señal específica y se auto fosforila en un dominio histidina. A continuación el fosfato es transferido al residuo aspártico del RR que se encuentra en el citoplasma. De esta forma, el RR se activa y desencadena una respuesta que será acorde a la señal recibida. Normalmente, una bacteria posee varios TCSs, siendo su número proporcional al tamaño del genoma, al número de ambientes distintos en las que es capaz de crecer y a la complejidad de su diferenciación celular. Así, bacterias que viven en ambientes muy constantes, como las bacterias intracelulares estrictas carecen de TCSs, mientras que bacterias que viven en ambientes diversos pueden poseer cientos de ellos. En relación con el número y la función de los TCSs existen varias preguntas que hasta ahora no han sido analizadas: ¿cuántos TCSs necesita una bacteria de vida libre? ¿Son necesarios los TCSs cuando la bacteria crece en un ambiente constante? ¿Existe activación cruzada entre TCSs distintos in vivo? Para responder a estas preguntas y realizar un estudio global de los procesos celulares controlados por los TCSs, en esta tesis hemos realizado una aproximación genética reduccionista usando como modelo dos cepas genéticamente no relacionadas de S. aureus. El trabajo ha consistido en la deleción completa de los 15 TCSs no esenciales que posee S. aureus y la mutación del sensor (WalK) del TCS walKR, cuya deleción completa resulta letal. Las bacterias resultantes carecen del sistema sensorial y su obtención demuestra que en condiciones ambientales constantes estos sistemas son dispensables para la vida de S. aureus. Los mutantes deficientes en los TCSs muestran niveles de crecimiento indistinguibles a los de la cepa salvaje a 37ºC y 44ºC y un patrón metabólico similar. En cambio, los mutantes tienen deficiencias en el crecimiento a 28ºC, pierden la capacidad de reducción de nitratos, muestran mayor sensibilidad al Tritón X-100 así como una menor capacidad para sobrevivir en el ambiente e invadir células. Así mismo, los mutantes tienen reducida su virulencia y capacidad de colonizar órganos en un modelo de infección de ratón. Todos los fenotipos del mutante deficiente en los TCSs podían ser restaurados por la expresión ectópica de un único TCS indicando que cada uno de los fenotipos depende de un único TCS. Finalmente, la cepa deficiente en los TCSs ha sido utilizada como una plataforma para el estudio de la especificidad de transmisión de señal in vivo, un concepto que en inglés se denomina ‘cross-talk’ y que hasta ahora había sido estudiada in vitro. Para ello, hemos establecido una sencilla metodología que consiste en la complementación del mutante deficiente en TCSs con una colección de plásmidos que contienen una combinación de la familia de HKs y un RR. El análisis de las cepas complementadas nos ha permitido identificar la existencia de activación cruzada entre GraS y ArlR. Esta activación cruzada tiene lugar incluso en presencia de sus correspondientes parejas, la HK ArlS y el RR GraR. Teniendo en cuenta que durante este análisis global sólo hemos detectado activación cruzada entre estos TCSs, la conclusión de nuestro estudio es que la activación cruzada entre los TCSs puede ocurrir in vivo, pero no es frecuente. En el futuro las cepas deficientes en los TCSs, o cepas derivadas conteniendo únicamente uno de ellos, servirán para identificar el regulón que controla cada TCS o para identificar nuevos fármacos que bloqueen específicamente a los TCSs.
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Estudio de las bases moleculares de la infección respiratoria por el patógeno bacteriano Haemophilus influenzae: efecto de la auxotrofía metabólica e implementación de un nuevo modelo experimental preclínico
(2018) Rodríguez Arce, Irene; Garmendia García, Juncal; Farrán Blanch, Inmaculada; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua proyecto 3/2016
Este trabajo de tesis doctoral se centra en el estudio de las bases moleculares de la infección respiratoria por la bacteria Haemophilus influenzae, miembro del microbioma respiratorio humano y patógeno oportunista de especial relevancia en la progresión de la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC).
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Desarrollo de vacunas marcadas con GFP frente a la brucelosis ovina y tests diagnósticos asociados
(2017) Zabalza Baranguá, Ana; Grilló Dolset, María Jesús; San Román Aberasturi, Beatriz; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
La brucelosis es una zoonosis extendida mundialmente con importantes repercusiones económicas y sanitarias, cuya principal fuente de infección para el ser humano son los pequeños rumiantes infectados por Brucella melitensis. En gran parte del mundo, el control de la brucelosis en estos animales debe basarse en la vacunación. B. melitensis Rev1 es la única vacuna disponible y recomendada internacionalmente para ovejas y cabras. Sin embargo, la vacunación con Rev1 genera una interferencia serológica que impide la Diferenciación entre Animales Infectados y Vacunados (DIVA), limitando el uso de esta cepa vacunal. Para tratar de solventar el problema DIVA, se ha desarrollado una técnica de marcaje xenogénico con la proteína de origen marino GFP. En el capítulo 1 de esta tesis, se obtuvieron dos isoformas de GFP recombinante y se desarrollaron tests serológicos utilizando dichas proteínas como antígeno diagnóstico. En el capítulo 2, se realizó el marcaje xenogénico de Rev1 con gfp mediante la inserción cromosómica dirigida de un mini-Tn7-gfp (Rev1::gfp) y un análisis serológico detallado, tanto en ratones BALB/c como en ganado ovino. La estrategia de vacunación con Rev1::gfp en mezcla con GFP y un booster posterior con GFP en hidróxido de aluminio, permitió identificar durante más de 6 meses post-booster a todos los animales que habían sido vacunados, utilizando las técnicas serológicas oficiales anti-LPS-S y un iELISA-GFP. Además, la vacuna clásica Rev1 posee otros inconvenientes como son su poder patógeno residual y resistencia a la estreptomicina, que recomiendan la búsqueda de nuevas vacunas frente a B. melitensis. Para ello, en el capítulo 3 se construyeron y caracterizaron los candidatos vacunales 16Δ.wzm y 16Δ.wzm::gfp, con LPS-R, a la vez que acumulan PS-0 en el interior bacteriano, y sensibles a estreptomicina. Estas propiedades confirieron una atenuación y eficacia frente a B. melitensis en ratones similares a las de Rev1. En corderos, la vacunación combinada de 16Δ.wzm::gfp con GFP generó una mínima interferencia en las pruebas convencionales con LPS-S y permitió identificar a los anímales vacunados mediante iELISA-GFP, sin necesidad de booster. Por otra parte, Rev1 ha permitido controlar la infección por Brucella ovis. En las zonas donde se ha abandonado la vacunación con Rev1, B. ovis es una patógeno emergente que causa graves pérdidas económicas. Puesto que no existe una vacuna específica frente a B. ovis, el capítulo 4 se centró en analizar las propiedades vacunales de una selección de cinco mutantes rugosos de B. melitensis obtenidos en un proyecto anterior, mediante inserción aleatoria del mini-Tn5. De ellos, se seleccionaron y construyeron por deleción en fase las cepas marcadas 16Δ.wzm::gfp (capítulo 3) y H38ΔwbkF::gfp (capítulo 4). Además, se seleccionó un mutante de B. ovis PA que había mostrado buenas propiedades en el modelo murino en un trabajo anterior, para su marcaje con el mini-Tn7-gfp, generando la cepa BoPAiΔomp10ΔugpBΔomp31::gfp. La vacunación con una de estas cepas marcadas, tanto por vía intraperitoneal como subcutánea, evidenció mejor protección con los mutantes de B. melitensis que con el triple mutante de B. avis en el modelo murino. Finalmente, se evaluó la inocuidad y respuesta serológica de 16MΔwzm::gfp y BoPAΔomp10iΔugpBfΔomp31::gfp en ganado ovino, tras la vacunación combinada del mutante con GFP y posterior booster con GFP en hidróxido de aluminio, siguiendo el protocolo descrito en el Capítulo 2. Al igual que con Rev1::gfp, esta estrategia permitió identificar por iELISA-GFP a todos los animales que habían sido vacunados, durante más de 4 meses post-booster. En conjunto, por un lado, el marcaje de Brucella con el mini-Tn7-gfp permitió conservar las propiedades microbiológicas y vacunales que poseían los correspondientes mutantes antes de ser marcados y, a su vez, permitió identificarlos fácilmente por visualización directa de la ftuorescencia y por una PCR-GFP múltiple específicamente diseñada. Por otro lado, Rev1::gfp y 16MΔwzm::gfp parecen buenas alternativas a Rev1 frente a infecciones por B. melitensis virulentas.
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Interference of iflavirus in SeMNPV as a biological control agent
(2017) Carballo Palos, Arkaitz; Caballero Murillo, Primitivo; Murillo Pérez, Rosa; Williams, Trevor; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
La rosquilla verde, Spodoptera exigua (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), es una especie polífaga ampliamente distribuida por todas las zonas templadas del mundo, incluyendo España, donde se ya ha establecido, causando grandes pérdidas económicas en cultivos hortícolas de invernadero. Como alternativa al control químico, el nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua (SeMNPV, Baculoviridae) se ha propuesto, por su especificidad y eficiencia, como una alternativa preferente para combatir las plagas de S. exigua en el ámbito de la producción integrada o biológica. La aplicación del virus en campo no solo mata a un elevado porcentaje de las larvas, sino que las que sobreviven al tratamiento adquieren una infección subletal que es transmitida a los individuos de las siguientes generaciones favoreciendo así el control mediante SeMNPV de estas poblaciones de S. exigua. Las infecciones encubiertas son un fenómeno muy habitual en las poblaciones naturales de insectos. De hecho, en las poblaciones de campo de S. exigua, se ha detectado un amplio complejo de virus mediante el uso de nuevas técnicas de secuenciación (Next-Generation Sequencing, NGS). Concretamente , en las poblaciones almerienses de S. exigua se han identificado dos nuevos virus de RNA de la familia ltlaviridae: iflavirus 1 (SelV-1) e iflavirus 2 (SelV-2). Ambos iflavirus se encuentran con relativa frecuencia produciendo infecciones mixtas con el SeMNPV . Aunque se sabe que estos virus no producen infecciones letales en los insectos, se desconoce los efectos que estas tienen sobre el insecto huésped y como interfieren sobre la capacidad insecticida del SeMNPV como agente de control biológico. El objetivo de esta tesis ha sido determinar algunos aspectos de las interacciones de los iflavirus SelV-1 y SelV-2, que infectan naturalmente a poblaciones de S. exigua, con el SeMNPV, que ha sido desarrollado como bioinsecticida para combatir las plagas causadas por S. exigua. En primer lugar, se estudió la prevalencia y abundancia de SelV-1 y SelV-2 en adultos de S. exigua de diferentes orígenes geográficos, para establecer su importancia en poblaciones naturales y experimentales de la plaga. Se determinó que ambos iflavirus infectaban de manera persistente a seis poblaciones de S. exigua de diversos orígenes establecidas en cautividad, aunque con variaciones en la abundancia relativa de ambos iflavirus según su procedencia. En estudios previos se había observado que las infecciones letales del SeMNPV en huéspedes infectados por SelV generaban OB (cuerpos de oclusión) con iflavirus asociados. Esta asociación mejora la estabilidad del iflavirus fuera del huésped y su transmisibilidad e infectividad. En cambio, las propiedades insecticidas de los OBs asociados a SelV se vieron reducidas. En concreto, se observó que la presencia de SelV disminuye la patogenicidad (CL50) de OBs de SeMNPV, aunque no hubo variaciones significativas en el tiempo letal del virus (TMM) o en la producción de 08 por larva en el momento de su muerte. En larvas coinfectadas con el SeMNPV y suspensiones de iflavirus enriquecidas en SelV-1, SelV-2 o una mezcla de ambos, se han estudiado aspectos como la patogenicídad, tiempo letal, producción de OBs tras la muerte de la larva y la prevalencia del SeMNPV en adultos supervivientes a la infección. La concentración letal media (CLso) del SeMNPV disminuyó en presencia de SelV, aunque el tiempo medio de mortalidad no resultó afectado. La producción de OBs fue significativamente inferior en los individuos coinfectados. En larvas de S. exigua del cuarto estadio coinfectadas con SeMNPV y SelV se observó una reducción del incremento de peso explicando así la diferencia de producción de OBs por larva. Por último, la prevalencia de SeMNPV no se vio modificada por una coinoculación con iflavirus, pero la carga viral del SeMNPV aumentaba con la presencia de SelV-2 con respecto al control y a SelV-1. Los OBs producidos en larvas de S. exigua coinfectadas por SeMNPV e iflavírus presentaban características físicas diferenciales que nos permitió separar dos subpoblaciones de OBs en función del número de SelV-1 asociados a los OBs. Estas dos subpoblaciones de OBs mostraban distinta densidad específica por lo que fueron separados en un gradiente de sacarosa. OBs con menor densidad específica presentaban un menor número medio de genomas por OB del SeMNPV debido a una mayor presencia de genomas de SelV-1.Aunque el número de ODVs por 08 no fue significativamente distinto en ambas subpoblaciones de OBs,sí se pudo demostrar que el número medio de nucleocápsidas por ODV fue menor en los OBs que llevaban asociados un mayor número de genomas de SelV-1. Este resultado está en consonancia con la baja infectividad que presentan los OBs asociados a iflavirus detectada anteriormente. Por último, y debido a la importancia de iflavirus en las poblaciones de S. exigua, se estudió como afectaba la infección por iflavirus a algunas de las características biológicas de S. exigua. Se comprobó que las infecciones del SelV-1 afectaron negativamente a la ganancia de peso de las larvas y pupa y la supervivencia del adulto, comparado con insectos no tratados. Sin embargo, la inoculación del SelV-2 no produjo variaciones en ninguno de los parámetros estudiados. El análisis de la evolución de la infección por SelV a lo largo del desarrollo larvario, de pupa y adulto del huésped reveló aumentos importantes en la carga del SelV-1, mientras que el SelV-2 se mantuvo siempre a niveles bajos (basales). Las larvas de S. exígua con infecciones persistentes por SelV-1, naturales o inducidas , presentaron una mayor susceptibilidad al SeMNPV. El valor de la CLso del SeMNPV para las larvas con infección persistente por SelV-1 fue más de 4 veces menor que las larvas libres de SelV-1, mientras que el TMM se redujo en 12 horas. A parte de estos efectos positivos, las infecciones persistentes de SelV-1 también pueden afectar negativamente a ciertas características del SeMNPV como son la capacidad insecticida de los OBs asociados a SelV y la transm isión horizontal del SeMNPV en el medio. La asociación de los iflavirus puede afectar a la seguridad del SeMNPV como agente de control biológico ya que estos iflavirus guardan una estrecha relación con otros virus de RNA patógenos para humanos (hepatitis, polio, etc.). Todo ello nos lleva a concluir que las infecciones de iflavirus en las poblaciones de S. exigua pueden ser un inconveniente para la bioseguridad y para la producción a gran escala de bioinsecticidas, que actualmente se basa en el uso de líneas de insectos vivos los cuales deberían estar libres de infecciones.
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Characterization of transposon activity and genome-wide epigenetic regulation throughout the life cycle of Pleurotus ostreatus
(2017) Borgognone, Alessandra; Ramírez Nasto, Lucía; Castanera Andrés, Raúl; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Most prokaryotic and eukaryotic life forms have to deal with the presence of repetitive DNA sequences called transposable elements (TEs), whose ability to mobilize through the genome and insert at random position has an impact on genome stability and functionality. For a long time, TEs were described as ‘selfish’ DNA fragments, owing to their proliferation within the host genome without conferring any benefit or inducing detrimental effects when inserted in gene coding regions. Over time, however, this view was changed by the discovery of the contribution of transposons in genome integrity and evolution. Recent genome-wide characterizations have focused on the distribution of these mobile elements and the effects of active transposon copies within closely related genomes. Given their mutagenic potential, host genomes have evolved endogenous mechanisms to limit the mobilization and repress the transcriptional activity of transposons. In higher organisms, repeat sequences are transcriptionally silenced through epigenetic modifications, which modulate gene expression without producing permanent modifications along the nucleotide sequence. The integrated and dynamic nature of epigenetic pathways, including DNA methylation and RNA-silencing systems, can be regulated at different levels, leading to the targeted silencing of specific genomic regions. Thus, the revolutionary advent of high-throughput sequencing led to an unprecedented opportunity to generate genome-wide epigenetic profiles and extend the understanding of the contribution of TEs in genome evolution. The filamentous fungi, in particular, Neurospora crassa and other ascomycetes, have provided fundamental advances in many of the aforementioned areas. These organisms possess complex epigenetic pathways that are also conserved in other higher eukaryotes to efficiently shut down transposon activity. Despite their importance, the occurrence of epigenetic events as well as the impact of transposon activity in basidiomycetes have been poorly analyzed so far. Recent studies in Pleurotus ostreatus uncovered that the genome of this basidiomycete model is populated by a diverse set of TE families, providing a detailed picture of the distribution and importance of helitrons, which are a group of DNA transposons that mobilize through a rolling-circle mechanism. Therefore, the principal aim of this work is to investigate the inheritance of helitron transposons and profile the epigenetic and transcriptomic landscape of P. ostreatus at different growing stages. Both objectives have been performed through the use of molecular techniques integrated with subsequent Sanger or Next-Generation sequencing data analysis. This PhD dissertation is comprised of four main chapters. Chapter I describes the current state-of-the-art of genome sequencing, transposon identification and epigenetic mechanisms (DNA methylation and RNA silencing pathways); it also provides an introductory overview on the fungal kingdom and the model system P. ostreatus. Chapter II presents the inheritance patterns of HELPO1 and HELPO2 helitron families in the meiotically-derived progeny of P. ostreatus. Our results report the distorted segregation patterns of HELPO2 helitrons that lead to a strong under-representation of these elements in the progeny. Further analyses of the HELPO2 flanking sites showed that the meiotic process of gene conversion may contribute to the elimination of such repetitive elements, favoring the presence of HELPO2 vacant loci. Moreover, the analysis of HELPO2 content in a reconstructed pedigree of subclones maintained under different culture conditions revealed an event of helitron somatic transposition. Additional investigations of genome and transcriptome data indicated that P. ostreatus carries active RNAi machinery that could be involved in the control of transposable element proliferation. These findings provide the first evidence of helitron mobilization in the fungal kingdom and highlight the interaction between genome defense mechanisms and invasive DNA using P. ostreatus as a model. Chapter III describes the occurrence of epigenetic defense strategies in this fungal model. The analyses report a picture of genome-wide epigenetic (DNA methylation and small RNAs) and transcriptional (mRNA) patterns in P. ostreatus throughout its life cycle. High-throughput sequencing analyses (BS-seq, sRNA-seq and mRNA-seq) performed in monokaryon and dikaryon samples revealed epigenetic differences among strains but not within developmental stages. Our results uncovered strain-specific DNA methylation profiles (~ 2 to 7 % global methylation levels) and 21-22nt small RNA production primarily involved in the repression of transposon activity. Furthermore, our findings provide evidence that TE-associated DNA methylation—but not small RNA production—is directly involved in the silencing of genes surrounded by transposons. Finally, these findings also report key genes that are activated in the fruiting process through a comparative analysis of transcriptomes. A general discussion on findings presented in this thesis is given in Chapter IV. This last part reports a critical outlook on the epigenetic and transcriptional state of the two helitron families of the P. ostreatus strains that are differentially subcultured during several years, as well as nucleus-specific methylation variations in dikaryotic strains that share an identical genetic complement but different subculture conditions.
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Chrysodeixis chalcites nucleopolyhedrovirus: a useful component for IPM programs on the Canary Islands banana crops
(2017) Fuentes Barrera, Ernesto Gabriel; Caballero Murillo, Primitivo; Simón de Goñi, Oihane; Hernández Suárez, Estrella; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
La platanera (Musa acuminata Colla) es uno de los principales cultivos de las Islas Canarias, representando el 30% de la producción agrícola total del archipiealago. Dicho cultivo se realiza bajo invernaderos de malla principalmente en las vertientes cálidas del sur de las islas, y al aire libre en las frías vertientes del norte. Por ello, los cultivos bajo malla presentan mayores poblemas fitosanitaríos. Chrysodeixis chalcites (Esper, 1789) (Lepidoptera: Noctuidae) ha sufrido cambios importantes en su hábitos alimenticios. Actualmente se alimenta principalmente de los frutos de platanera, produciendo dafios en la epidermis que reducen claramente su valor comercial. El control de dicha plaga implica el uso repetido de un reducido número de materias activas, lo que favorece la aparición de resistencia, y por lo tanto disminuyendo su efectividad. Además, desde el año 2014 la gestión integrada de plagas (GIP) es de obligado cumplimiento en los sistemas de cultivo españoles. El objetivo de esta tesis ha sido abordar varios algunos aspectos importantes para la implementación de un programa de GIP efectivo en los cultivos de platanera de las Islas Canarias, España. La toma de decisiones efectiva en GIP se basa en la comprensión de las relaciones que se producen entre el número de individuos plaga, la respuesta de las plantas a los daños producidos por dichos individuos y las pérdidas económicas resultantes. Por ello, en la presente tesis se estimó en primer lugar la incidencia y el daño alimenticio producido por C. chalcites, así como las pérdidas de producción debidas al daño directo a la fruta y al coste indirecto derivado de la compra y aplicación de insecticidas. La prevalencia de infestaciones varió entre el 42 y 100% y fue similar en tos dos años de prospecciones. El daño foliar medio (1.5-7.3%) y el daño en fruta (1.0-5.7%) varió significativamente en las islas según el tipo de plantación (vertientes orientadas al norte o al sur) y estación. En general, los daños resultaron similares entre los dos tipos de plataciones, excepto en Gran Canaria y Tenerife, donde se registaron más daños foliares y en fruto, respectivamente , en la vertiente sur. Los daños también fueron similares entre las estaciones, Jo que indica que C. chalcites está presente en el cultivo durante todo el año. El peso de plátanos dañados respecto a la fruta cultivada varió significativamente entre las islas, desde el 0,2% en Tenerife hasta el 4,2% en El Hierro, siendo este daño especialmente importante en primavera. Dicho periodo es el más susceptible para determinar la cantidad y calidad de la fruta cosechada, ya que coincide con el desarrollo del fruto tras la floración. En total se perdieron unas 3.155 toneladas de platano/año, lo que representa el 1,5% de la producción anual (2,68 millones de euros/afio). Además, los costes de control con indoxacarb, el insecticida más utilizado (73%), supondrían unos 240€/ha por ciclo de cultivo. Dado que su uso continuado probablemente favorezca el desarrollo de resistencia, se necesitan nuevos insecticidas para rotar con los pocos productos autorizados . Entre ellos el nucleopoliedrovirus de C. chalcites, ChchNPV (Género Alphabaculovirus, Baculoviridae) resulta ser un insecticida seguro, eficiente y sostenible. El siguiente objetivo fue evaluar el uso potencial de ChchNPV como un nuevo agente de control biológico en GTP. Para ello, primero se estimó Ja prevalencia y diversidad genética de las variantes de ChchNPV presentes en las poblaciones naturales de C. chalcites en Canarias y después se evaluó la eficacia insecticida del aislado más prevalente en comparación con dos insecticidas usados frecuentemente, indoxacarb y Bacillus thuringiensis (Bt), a pequeña escala en plantas jóvenes de platanera en condiciones de invernadero y aire libre. En general, la prevalencia de infección por ChchNPV fue del 2,3%, siendo de 0-13,8% en El Hierro, 0-5,6% en La Palma, 0-4,8% en Tenerife, 0-1% en La Gomera y 0% en Gran Canaria. En plantaciones bajo invernadero, la prevalencia de infección fue el doble (3%) que al aire libre (l,4%). ChchNPV-TF1 fue la variante más abundante (82%) y extendida, por lo que se seleccionó para los ensayos de campo. La aplicación 109 cuerpos de oclusión (OBs)/I de ChchNPV-TF1 redujo significativamente la densidad larvaria y el daño foliar en plantas jóvenes de platanera, al igual que los productos convencionales indoxacarb y Bt. Sin embargo, la mayor mortalidad producida por ChchNPV-TF1 en las larvas recolectadas a lo largo del tiempo sugiere que adquisición de una infección letal ocurre durante un periodo de tiempo más extendido, en comparación con el breve periodo que manifiestan las larvas tratadas con los insecticidas convencionales. Estos resultados indican una mayor persistencia de ChchNPV-TF1 en la p!anta de platanera. El último objetivo de este trabajo abordó la evaluación de la eficacia de ChchNPV-TF1 para proteger los frutos de platanera de los daños producidos por C. chalcites en invernaderos de malla en plantaciones comerciales, durante un ciclo de cultivo completo en comparación con el tratameitno convencional. En los ensayos de 2014, el daño foliar fue similar entre las dos estrategias de control en las tres islas, mientras que el daño en fruto en las parcelas tratadas con ChchNPV-TF1 fue sorprendentemente mayor en Tenerife, pero similar en Gran Canaria y La Palma. En Tenerife y Gran Canaria Ja mortalidad larvaria fue mayor en la parcela tratada con ChchNPV-TFl, mientras en La Palma la baja incidencia no permitió determinar la mortalidad larvaria. En un segundo ensayo en Tenerife en 2015 los tratamientos con virus se aplicaron varios meses antes del dasarrollo del fruto, y esta vez ChchNPV-TF1 proporcionó un control efectivo, similar al proporcionado por los insecticidas convencionales. En conclusión, este nuevo agente de control biológico resulta útil para ser incluido en la gestión integrada de C. chalcites en cultivos de platanera de Canarias. Los resultados de esta tesis forman parte de un trabajo más amplio que tiene como objetivo definir los umbrales de daño de C. chalcites en cultivos de platanera y el uso potencial de este nuevo insecticida biológico.
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Patho-adaptive evolution of Haemophilus spp. bacterial respiratory colonizing opportunistic pathogens
(2018) Moleres Apilluelo, Javier; Garmendia García, Juncal; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Esta tesis doctoral se ha centrado en tres aspectos de la pato-adaptación de dos especies bacterianas relacionadas filogenéticamente, que colonizan de forma asintomática y también son patógenos oportunistas en los sistemas respiratorios porcino y humano, respectivamente. Para ello, hemos analizado rasgos de evolución patoadaptativa bacteriana en un modelo de trabajo experimental (Capítulo 2) y de forma natural dentro del hospedador (Capítulos 1 y 3).
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Functional analysis of the RNA chaperone CspA in Staphylococcus aureus
(2018) Caballero Sánchez, Carlos; Toledo Arana, Alejandro; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
En esta tesis se pone de manifiesto que las chaperonas de RNA, como CspA, pueden interactuar de manera específica con estructuras de RNA, que a su vez pueden ser reconocidas por otras RBPs. Esto contribuye a un mejor entendimiento de la regulación mediada por este grupo de chaperonas de RNA. Además, se destaca la importancia de los elementos reguladores intrínsecos, presentes en cada mRNA, y se propone que la interacción de dichos elementos con distintas RBPs es un factor clave para la correcta expresión proteica que, en última instancia, permite el adecuado desarrollo de todos los seres vivos.
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Biofuncionalización de nanoestructuras para aplicación en sistemas de detección
(2017) Ciáurriz Gortari, Paula; Fernández Santos, Fátima; Solano Goñi, Cristina; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua
La presente tesis doctoral, enmarcada en el campo de nanobiotecnología, presenta el desarrollo de diversas estrategias de biofuncionalización de nanoestructuras con diferentes propiedades con el fin de ser aplicadas en sistemas de detección tipo inmunoensayos e inmunosensores. Este trabajo se aborda desde dos perspectivas: biofuncionalización de (i) nanopartículas y (ii) superficies nanoestructuradas. La primera parte se centra en la evaluación de diversos factores en las características y funcionalidad de conjugados de nanopartículas de oro (AuNPs) y carbono (CNPs) con enzimas y/o anticuerpos. Se comparan las estrategias de unión covalente y adsorción mediante la conjugación de la enzima hierro superóxido dismutasa (FeSOD) a AuNPs a través de un brazo de unión. Se observa que la unión covalente resulta algo más favorable en cuanto a cobertura y actividad enzimática, además de mayor estabilidad frente a variaciones de fuerza iónica y pH del medio, si bien la reproducibilidad de ambas estrategias es algo reducida. Asimismo, se muestra que es posible manipular la disposición de las enzimas secuenciales glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa (HRP) sobre CNPs mediante la modificación del orden de incubación y las proporciones proteína:CNP, lo que afecta a la actividad del complejo. Se comprueba que la GOx presenta mayor afinidad por las CNPs, si bien su actividad se ve afectada, al contrario que la HRP, cuya eficiencia catalítica aumenta tras la unión a CNPs. Por otra parte, se comparan diferentes metodologías de biofuncionalización de AuNPs con anticuerpos y la enzima HRP, adsorción directa, covalente o covalente orientada, con el fin de comparar su potencial para mejorar la sensibilidad del inmunoensayo ELISA. La unión por adsorción proporciona una mayor capacidad de amplificación, consiguiendo un aumento en la sensibilidad en la detección del alérgeno gliadina de seis veces mediante ELISA indirecto. La segunda parte presenta la caracterización de un novedoso biosensor óptico basado en nanoestructuras periódicas de pilares resonantes (RNP) formados por multicapas de SiO2/Si3N4. Se describe el desarrollo del proceso de biofuncionalización de estos materiales dispuestos en nanopilares, aplicando diferentes estrategias de activación, silanización y unión covalente de biomoléculas, llegando a un protocolo de biofuncionalización estable y reproducible. Asimismo, se desarrolla un protocolo para la detección de la interacción antígeno-anticuerpo empleando el modelo IgG-anti-IgG y un formato directo, demostrando la capacidad de los RNP como sensores a tiempo real (real time) y en ausencia de marcadores (label-free). Además, es posible regenerar esta interacción, permitiendo la re-utilización de la superficie. Este procedimiento es empleado para el desarrollo de métodos de medida para la detección de analitos de bajo peso molecular (ácido ocadaico y bifenilo policlorado 169) en el rango de ng/ml aplicando un formato competitivo.
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Expresión de marcadores moleculares implicados en la adipogénesis en el tejido intramuscular en vacuno de carne
(2017) Martínez del Pino, Lara; Arana Navarro, Ana; Soret Lafraya, Beatriz; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
En vacuno, la grasa intramuscular (GIM) o veteado es esencial para la palatabilidad de la carne, por lo tanto es un factor importante que afecta a la calidad de ésta. El contenido en GIM puede estar relacionado con la distinta localización anatómica de los músculos, las funcionalidades de los mismos e, incluso, por su metabolismo o tipo de fibra. También es conocido que en distintas razas, la GIM se desarrolla de forma diferente durante el crecimiento, dando lugar a distintos grados de acumulación de GIM y veteado en el momento del sacrificio de los animales. El desarrollo de la GIM se produce en un entorno característico, embebida entre fibras musculares y tejido conectivo. Dado que los adipocitos, los miocitos y los fibroblastos, es decir las células características de los tejidos adiposo, muscular y conectivo respectivamente, comparten un origen común, las vías señalización y la regulación de la formación de dichos tejidos, y no solo las implicadas con el tejido graso, podrían influir en la deposición de la GIM. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el desarrollo de la GIM en distintos músculos de dos razas de ganado vacuno con distinta precocidad en la acumulación de GIM, además de la expresión génica de factores implicados en la formación de adipocitos (adipogénesis), músculo (miogénesis) y tejido conectivo (fibrogénesis). Con este propósito, el primer ensayo se centró en estudiar la GIM y la expresión de genes adipogénicos clave en distintos músculos de terneros Pirenaicos, una raza orientada a la producción de carne que presente una baja tendencia al engrasamiento y en particular para la acumulación de GIM. Para ellos, se cuantificó el porcentaje de GIM, proteína y humedad en muestras de los músculos longissimus thoracis (LT), semitendinosus (SM), masseter (MS), sternomandibularis (ST) y en el tejido adiposo subcutáneo (SC) de terneros de raza Pirenaica (n = 4). También se estudió la distribución de tamaño de los adipocitos y la expresión génica de genes clave en la adipogénesis (PPARG, CEBPA, FAPB4 y WNT10B). En los músculos MS y SM se observó un mayor contenido en GIM, en los que la distribución del tamaño de los adipocitos fue bimodal mientras que en los músculos LT y ST, con menor contenido en grasa intramuscular, fue unimodal. Esto sugiere que la diferente acumulación de GIM por parte de los músculos estudiados podría estar relacionada con diferencias en la hiperplasia e hipertrofia y con un desarollo más tardío de la GIM en los músculos LT y ST. Estas diferencias, sin embargo, no fueron reflejadas por la expresión de los genes analizados, a excepción del gen FABP4, que se expresó más en el músculo LT que en los músculos MS y SM. Al comparar la expresión de los genes estudiados en el depósito intramuscular y en el SC, la expresión de PPARG, CEBPA y FABP4 fue mayor en el SC, lo que concordaba con el mayor tamaño de los adipocitos observado en este depósito. Con el fin de realizar una comparación entre distintas razas además de entre músculos, en el segundo y tercer ensayo, además de la raza Pirenaica se estudió también la raza Frisona (n = 4). Se seleccionaron como representativos los músculos LT y MS de ambas razas y se procedió a cuantificar el contenido de GIM, proteína, humedad, colágeno total y colágeno soluble así como al análisis de la distribución de tamaño de los adipocitos. Además, se analizó la expresión de genes implicados en la formación de adipocitos y adipoquinas (PPARG, CEBPA, FAPB4, WNT10B, Zfp423, ADIPOQ, LEP), de genes miogénicos y mioquinas (Myf5, MyoD, MyoG, Mstn), y de los genes fibrogénicos (FN1, FGFR1, FBF1, FGF2, TGFB1). En ambas razas, el músculo LT presentó una distribución unimodal de los adipocitos, aunque éstos fueron de un tamaño medio mayor en la raza Frisona de acuerdo con su mayor contenido en grasa. Por otro lado, igualmente en ambas razas, el músculo MS presentó una distribución bimodal; en este caso no se observaron diferencias en el tamaño de los adipocitos ni en la cantidad de grasa. Comparando cada raza de forma independiente, en los terneros de raza Pirenaica el contenido de GIM fue mayor en el músculo MS en comparación con LT. En terneros Frisones sin embargo, a pesar de presentar diferente distribución del tamaño de los adipocitos, los músculos LT y MS, presentaron un contenido similar de GIM. Los resultados del estudio de la expresión génica indicaron que los genes adipogénicos CEBPA, WNT10B y la adipoquina LEP no presentaron diferencias de expresión entre los músculos y las razas analizadas. Sin embargo, la expresión del gen PPARG fue mayor en los músculos LT y MS de los terneros de raza Pirenaica, al contrario que el gen FABP4 cuya expresión fue mayor en ambos músculos de terneros Frisones. Por otra parte, comparando los dos músculos en terneros Frisones, el gen Zfp423 se expresó más en el músculo LT mientras que hubo una mayor expresión de la adipoquina ADIPOQ en el músculo MS. Los genes relacionados con la fibrogénesis FN1, FGFR1, FGF2 y TGFB1 mostraron una expresión similar entre los músculos y razas analizadas, al igual que se observó que no había diferencias en el contenido de colágeno total y soluble. Por último, atendiendo a la expresión de los genes miogénicos y la mioquina estudiados, MyoG no presentó diferencias entre las razas Pirenaica y Frisona y los músculos LT y MS. Sin embargo, para el músculo MS de terneros Frisones, la expresión de Myf5 resultó ser mayor en comparación con los terneros Pirenaicos mientras que la expresión de MyoD fue mayor en el músculo LT de ambas razas. La expresión de la mioquina Mstn fue mayor en los dos músculos de la raza Pirenaica mientras que para los terneros Frisones, se expresó más en el músculo LT que en el MS. Los resultados de expresión génica cuantificados por medio de la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR) utilizada en el presente trabajo, pueden verse afectados por distintos factores, aparte del animal, del tejido o del tratamiento experimental ensayado, relacionados con la variación asociada al trabajo experimental. . Por lo tanto, en orden a optimizar el diseño experimental y lograr un análisis más preciso de los resultados, en cada estudio se realizó un análisis de variabilidad de los diferentes factores que afectan los resultados de RT-qPCR. Este estudio indicó que los factores analíticos que aportan mayor variabilidad a la expresión génica fueron la muestra (réplica en el muestreo) y la etapa de RT. Por lo tanto, sería apropiado diseñar los futuros experimentos teniendo en cuenta la variabilidad debida a estos factores.
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Identification, characterization and evolutionary history of the Escherichia coli glycogen operon
(2014) Almagro Zabalza, Goizeder; Pozueta Romero, Javier; Baroja Fernández, Edurne; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Representing one of the major storage carbohydrate in many bacteria, glycogen is a branched homopolysaccharide of α-1,4-linked glucose subunits with α-1,6-linked glucose at the branching points that accumulates under conditions of limiting growth when an excess of carbon is available and other nutrients are deficient. The exact role of this polyglucan in bacteria is not as clear-cut as in animal and yeast cells, but some studies have linked glycogen to extended bacterial survival, symbiotic performance, colonization and virulence. It is widely accepted that genes involved in Escherichia coli and Salmonella enterica glycogen metabolism are clustered in two tandemly arranged operons: glgBX (encompassing the genes coding for glycogen branching (GlgB) and debranching (GlgX) enzymes), and glgCAP (encoding the GlgC and GlgA anabolic enzymes, as well as the catabolic glycogen phosphorylase (GlgP)). However, the data regarding regulatory aspects of the expression of glycogen genes in E. coli are contradictory, thus questioning the presence of two operons. To get inshight into the trascriptional organization of glycogen genes, in the first chapter of this work I characterized glg genes transcription using RT (reverse transcriptase)-PCR approach. This analysisW revealed that E. coli cells possess transcripts comprising the five glgBXCAP genes. glg::lacZY expression analyses in cells lacking the region immediately upstream of the glgB gene revealed an almost total abolishment of glgB, glgX and glgC expression and a reduced expression of glgA and glgP. Similar type of analyses showed that glgA and glgP expression was almost totally abolished in cells lacking glgA upstream sequences, including glgC, glgB and the asd-glgB intergenic region upstream of glgB. All the data indicate that the five glgBXCAP genes are transcribed in a single transcriptional unit under the control of promoter sequences upstream of glgB and that an alternative suboperonic promoter driving glgA and glgP expression is located within glgC. Using computer searches for putative bacterial promoters and 5¿ RACE (rapid amplification of cDNA ends) techniques I identified the -35 and -10 sequences of both promoters as well as the trasnscription start sites. Finally, I measured glg::lacZY expression on cells lacking the relA or phoP regulatory genes. These analyses indicated that both glgBXCAP operon and the suboperonic promoter form part of RelA and PhoP-PhoQ regulons. To gain insight into the origin and evolutionary history of E. coli glgBXCAP operon and of its constituent genes, in the second chapter of this work I carried out a detailed comparative analyses of presence, copy number and arrangement of glg genes in 265 gammaproteobacterial species. These analyses revealed the occurrence of large variations in glg homolog copy number and arrangements. Subsequently, I carried out a phylogenetic analysis of glg genes of selected Gammaproteobacteria and I also explored the phylogenetic relationships of gammaproteobacterial glg genes with those of representative species of the main bacterial groups. I found an important discrepancy between the evolution of glg genes and the order of organismal descent, inferred from 16S rRNA analysis, indicating that glg genes have undergone a complex evolutionary history in which horizontal gene transfer have played an important role. However, I detected a notable exception constituted by Enterobacteriales/Pasteurellales (E/P) glg genes which show a strict vertical inheritance. These analyses also revelaed that E/P glg genes are related with glg genes of phylogenetically distant betaproteobacterial species Varivorax paradoxus S110, Thiomonas intermedia K12, Lepthotrix cholodnii SP-6 and Thauera mz1t. The genomic context analysis indicated that the glgBXCAP arrangement is conserved in the E/P group and interestingly, that the above mentioned betaproteobacterial species possess glgBXCAP and/or gene clusters very similar to glgBXCAP. The overall data allowed me tracing the evolutionary origin of glgBXCAP operon in the last common ancestor of the E/P group and suggest a possible horizontal gene transfer event of the glgBXCAP cluster from the E/P group to Betaproteobacteria.
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Post-transcriptional regulation mediated by 3’-UTRs in bacteria
(2014) Ruiz de los Mozos Aliaga, Igor; Toledo Arana, Alejandro; Lasa Uzcudun, Íñigo; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
The presence of regulatory elements in the 3’ untranslated region (3’-UTR) of eukaryotic mRNAs controlling RNA stability and translation efficiency is widely recognized. In contrast, the relevance of 3’-UTRs in bacterial mRNA functionality has been disregarded. Here, we report evidences showing that around one-third of the mapped mRNAs of the major human pathogen Staphylococcus aureus carry 3’-UTRs longer than 100-nt and thus, potential regulatory functions. We also found that most of the long 3’-UTR ends in a Rho-independent transcriptional terminator. Based on this information, it is possible to predict 3’-UTRs in any bacteria. Thus, we analysed 25 genomes and found that 3’-UTRs longer than 100-nt are broadly distributed in prokaryotes. To evaluate the role that 3’-UTRs may play in controlling mRNA expression, we selected the long 3’-UTR of icaR mRNA, which encodes the repressor of the main exopolysaccharidic compound of the S. aureus biofilm matrix. We showed that base pairing between the 3’-UTR and the Shine-Dalgarno (SD) region of icaR mRNA interferes with the translation initiation complex and generates a double-stranded substrate for RNase III. We also unveiled that the icaR 5’-UTR controls the 5’-3’-UTRs interaction in response to temperature. At environmental temperature (23ºC), a three way-helical junction structure, generated by pairing of internal sequences from 5’-UTR and ORF regions, impairs the 5’-3’-UTR interaction, causing the accumulation of IcaR repressor and the inhibition of biofilm development. In contrast, at the human body temperature (37ºC), this structural conformation opens allowing the interaction of the 5’- and 3’- UTRs that inhibited IcaR translation leading to biofilm production. Our findings provide a singular example of a new potential post-transcriptional regulatory mechanism to modulate bacterial gene expression in response to temperature shifts through the interaction of a 3’-UTR with the 5’-UTR of the same mRNA.
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Advanced studies of yeast metabolism under winemaking conditions. Paving the way for a predictive model
(2014) Martínez Moreno, Rubén; González García, Ramón; Morales Calvo, Pilar; Quirós Asensio, Manuel; Pisabarro de Lucas, Gerardo; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
The main objective of this PhD project is to contribute to the development of a quantitative model of Saccharomyces cerevisiae metabolism in winemaking conditions. This model would allow to assess the effect of different environmental variables and of a particular starter yeast strain not only on fermentation kinetics but also on the production of relevant fermentation products (such as ethanol, glycerol, acetic acid, or some volatile compounds). This model would be useful in the improvement and control of the fermentation process, as well as in the definition of a rational use of enological additives and starter cultures, in order to ensure and improve wine quality.
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The role of plastidic phosphoglucose isomerase in the response of Arabidopsis thaliana to volatile compounds emitted by pathogenic microorganisms
(2016) Sánchez López, Ángela María; Pozueta Romero, Javier; Bahaji, Abdellatif; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
El almidón es un homopolímero ramificado de residuos de glucosa unidos covalentemente a través de enlaces de tipo α-1,4 y α-1,6. Sintetizado en el plastidio, este polisacárido de reserva constituye la forma principal de almacenamiento de carbohidratos en plantas superiores y un determinante importante tanto del crecimiento de la planta como de su relación con el entorno. Está ampliamente aceptado que el proceso de biosíntesis del almidón en hojas tiene lugar exclusivamente en el cloroplasto. Según esta interpretación, el almidón es el producto fi nal de una ruta metabólica conectada con el ciclo de Calvin- Benson (CBC) a través de la fosfoglucosa isomerasa plastidial (pPGI). Esta enzima cataliza la conversión de moléculas de fructosa-6-fosfato del CBC en moléculas de glucosa-6-fosfato, las cuales son metabolizadas en almidón a través de la acción combinada de la fosfoglucomutasa, la ADP-glucosa pirofosforilasa y la almidón sintasa. Las plantas perciben estímulos bióticos mediante el reconocimiento de una gran cantidad de compuestos procedentes de los organismos con los que interactúan. En este sentido cabe destacar que los microorganismos de la rizosfera sintetizan una gran cantidad de sustancias que regulan el desarrollo y el crecimiento de la planta. Además, estos microorganismos emiten una amplia gama de compuestos volátiles (VCs) que actúan como “infoquímicos” en la comunicación entre la planta y el microorganismo. Estudios llevados a cabo por el grupo de investigación en el que he desarrollado este trabajo de tesis doctoral demostraron que los VCs emitidos por una amplia gama de microorganismos (incluyendo patógenos y especies que normalmente no interactúan con la planta) fomentan la acumulación de cantidades excepcionalmente elevadas almidón en la planta. Dada la falta de conocimiento sobre los mecanismos implicados en este fenómeno y teniendo en cuenta a su vez el papel importante que juega el almidón en la interacción de la planta con su entorno, en este trabajo de tesis doctoral investigué las bases moleculares implicadas en la respuesta de la planta a los VCs microbianos, prestando especial atención al papel que juega la pPGI en esta respuesta. El primer capítulo de este trabajo describe la caracterización de dos mutantes (pgi1-2 y pgi1-3) carentes de actividad pPGI. Ambos acumulan en sus hojas un 10- 15% del almidón existente en hojas de plantas salvaje (WT). Contrariamente a lo que pudiera esperarse al tener en cuenta la interpretación clásica de la biosíntesis de almidón, análisis por microscopía revelaron la presencia de gránulos de almidón en cloroplastos de las células del mesófi lo de estos mutantes. Tanto pgi1-2 como pgi1-3 mostraron un crecimiento lento, una reducida capacidad fotosintética y un bajo balance NAD(P)H/NAD(P) con respecto a plantas WT. Estudios hormonómicos mostraron que el contenido de citoquininas (CKs) plastidiales en hojas pgi1 es muy reducido con respecto al existente en hojas WT. Además la aplicación exógena de CKs revirtió el fenotipo de defi ciencia de almidón de hojas de plantas pgi1. Los datos presentados en este trabajo indican que pPGI es un importante determinante de la fotosíntesis, el estado redox de la célula, el crecimiento y la acumulación de almidón en células del mesófi lo como consecuencia de su implicación en la producción de intermediarios de la vía oxidativa de las pentosas fosfato/glicólisis necesarios para la síntesis CKs plastidiales y poder reductor. El capítulo 2 muestra que VCs emitidos por microorganismos fi logenéticamente distantes (incluyendo bacterias y hongos benefi ciosos y patógenos) promueven el crecimiento, la acumulación de niveles excepcionalmente elevados de almidón y la fl oración en varias especies de plantas, incluidos cultivos de interés agronómico. Además, plantas de Arabidopsis expuestas a VCs emitidos por el fi topatógeno Alternaria alternata experimentaron un incremento en la fotosíntesis y un aumento del contenido de CKs. La magnitud de este fenómeno fue reducida en el mutante 35S:AtCKX1 defi ciente en CKs y en el mutante ahk2/3 de señalización de CKs, proporcionando así evidencia de que este tipo de hormonas juega un papel importante en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. El análisis transcriptómico de hojas de Arabidopsis expuestas a VCs de A. alternata reveló cambios en la expresión de genes regulados por luz y CKs implicados en la fotosíntesis, la fl oración, el crecimiento y el metabolismo del almidón. Sorprendentemente, una gran cantidad de genes diferencialmente expresados en plantas tratadas con VCs de A. alternata son genes cuya expresión se ve alterada también en plantas expuestas a VCs emitidos por la bacteria benefi ciosa Bacillus subtilis GB03, sugiriendo que las plantas han desarrollado la capacidad de reaccionar a VCs emitidos por diferentes microorganismos a través de la activación o estimulación de mecanismos altamente conservados. Para entender mejor los mecanismos implicados en las respuestas de las plantas a los VCs emitidos por microorganismos e investigar en qué medida pPGI está implicada en este fenómeno, en el trabajo presentado en el capítulo 3 se caracterizó la respuesta del mutante pgi1-2 a los VCs emitidos por A. alternata. VCs emitidos por este hongo fi topatógeno promovieron el crecimiento, la fotosíntesis y la acumulación de CKs plastidiales en hojas pgi1-2. Contra todo pronóstico, VCs emitidos por A. alternata promovieron la acumulación de niveles excepcionalmente elevados de almidón en hojas pgi1-2. Análisis proteómicos revelaron que los VCs microbianos promueven cambios en la acumulación de proteínas involucradas en la fotosíntesis, el metabolismo del almidón y el crecimiento que pueden explicar las respuestas observadas en plantas pgi1-2. Los datos presentados en este capítulo muestran que las plantas de Arabidopsis son capaces de responder a VCs microbianos mediante la activación o la estimulación de mecanismos independientes de pPGI.
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Transposable elements in basidiomycete fungi: dynamics and impact on genome architecture and transcriptional profiles
(2017) Castanera Andrés, Raúl; Ramírez Nasto, Lucía; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Transposable elements (TE), also known as mobile elements or transposons, are enigmatic genetic units that have played important roles in the evolution of eukaryotes. Their impact on genome architecture and phenotypic traits has been widely studied in plants and animals, ever since their discovery in maize during the 1950s by Barbara McClintock. Their ability to move from one locus to another makes them natural tools for generating diversity, as this characteristic leads to genomic alterations with deleterious, neutral, or beneficial effects on hosts. Thus, their survival in the genome depends on the equilibrium between their own benefit and their host’s “permissibility.” Plant and animal TEs have received much attention, yet very little is known about their occurrence and impact on the fungal kingdom. In fact, the first fungal TE was described in Neurospora crassa in 1989, about 40 years later than the discovery of the first TE in plants. Today, revolutionary advances in genome sequencing have opened the possibility of studying non-model species at a whole-genome level. The number of fungal-sequenced genomes increases daily at an unprecedented rate, and most efforts are being concentrated on basidiomycetes, a group of fungi of great interest due to their role in natural ecosystems and their use in multiple industrial applications. In this sense, the amount of genomic information released offers a unique opportunity to start deciphering the effect that mobile, repetitive elements have on fungal genomes. At the time of the start of this PhD thesis (January 2013), very little information regarding basidiomycete TEs existed, as most research was focused on the functional characterization of protein-coding genes. In light of these precedents, the main topics covered in this work are the distribution, characteristics, and impact of transposons in fungal genomes, with an emphasis on basidiomycetes. Using Pleurotus ostreatus as a working model, bioinformatics pipelines have been developed to dig into the extensive genomic data to obtain high quality TE annotations. This approach has allowed for the quantification and characterization of the transposon load of many fungal species and for the testing of hypotheses about the effect that TE insertions produce at the genomic and transcriptomic level.
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Insights into c-di-GMP signaling and the PGA exopolysaccharide biological functions using Salmonella as a model organism
(2017) Echeverz Sarasúa, Maite; Lasa Uzcudun, Íñigo; Solano Goñi, Cristina; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
Salmonella es un patógeno alimentario de gran relevancia clínica capaz de adherirse a superficies y formar comunidades bacterianas embebidas en una matriz que ellas mismas producen denominadas biofilms. Esta matriz confiere a las bacterias protección frente a agentes externos, aumentando su tolerancia frente a condiciones ambientales adversas, agentes antimicrobianos o el sistema inmune del hospedador. Existe una vía de señalización, mediada por el dinucleótido cíclico, c-di- GMP, que controla en muchas especies bacterianas la síntesis de diversos componentes de la matriz del biofilm, de manera que concentraciones elevadas de este nucleótido activan la producción de la matriz y por lo tanto del biofilm. La formación de biofilms en explotaciones agropecuarias y lugares donde se procesan alimentos es una fuente potencial de contaminación y de transmisión de este patógeno. Diversas medidas de higiene y seguimiento han sido implementadas por las autoridades para el control de esta bacteria; sin embargo alrededor de 93 millones de personas en todo el mundo sufren salmonelosis cada año. Por ello, la búsqueda de medidas alternativas de control, basadas en la vacunación animal, así como el estudio de los mecanismos de patogenicidad y formación de biofilm de Salmonella han sido el objeto de este trabajo.
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Study of the molecular mechanisms underlying Bap-mediated cell-cell interactions in Staphylococcus aureus
(2016) Taglialegna, Agustina; Lasa Uzcudun, Íñigo; Valle Turrillas, Jaione; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
La mayoría de los microorganismos son capaces de vivir en comunidades sésiles, siendo esta forma de crecimiento bastante más frecuente que la forma de vida planctónica. En estas comunidades microbianas, conocidas como biofilms, las células crecen adheridas a un sustrato y embebidas en una matriz exopolimérica que ellas mismas producen, y que confiere numerosas ventajas a la población: integridad estructural, protección ante factores externos, y control de la absorción de nutrientes. La composición de esta matriz extracelular es sumamente compleja, variando entre diferentes especies bacterianas y siendo muy susceptible a los cambios que puedan ocurrir en el ambiente circundante. Aproximadamente el 97% de la matriz es agua; el resto es una mezcla de nutrientes, metabolitos, productos de la lisis celular y polímeros secretados (polisacáridos, lípidos, DNA, proteínas). Staphylococcus aureus, una bacteria comensal y patógena causante de numerosas infecciones agudas y crónicas tanto en animales como en humanos, tiene la capacidad de desarrollar biofilms sobre una gran diversidad de superficies vivas e inertes. Esto representa para la bacteria un importante factor de virulencia que aumenta su persistencia y patogenicidad. Por ello, la sociedad científica ha dedicado grandes esfuerzos a lo largo de las ultimas décadas en descifrar la composición de la matriz extracelular estafilocócica, las características estructurales de sus elementos, así como las vías de regulación y los procesos moleculares que controlan su composición. Estudios recientes han puesto de manifiesto que las proteínas son uno de los componentes mayoritarios de la matriz extracelular de S. aureus, sin embargo, actualmente poco se sabe acerca de los aspectos relacionados con su organización espacial en la matriz del biofilm y de las interacciones moleculares con otros componentes de la matriz extracelular o de la célula huésped. En el presente trabajo, hemos estudiado los mecanismos moleculares mediante los cuales la proteína Bap (Biofilm associated protein) es capaz de inducir la interacción intercelular en S. aureus. Bap es una proteína de alto peso molecular que se encuentra anclada covalentemente a la superficie bacteriana mediante un mecanismo dependiente de la enzima sortasa. Hemos determinado que la proteína Bap interconecta células de S. aureus a través de un proceso de autoensamblaje que da lugar a agregados de tipo amiloide en respuesta a determinadas condiciones ambientales. Mas específicamente, nuestros resultados indican que Bap sufre un procesamiento en el que se liberan fragmentos que contienen la región N-terminal. Esta región tiene una conformación de tipo glóbulo fundido (molten-globule) que cambia a una estructura rica en láminas β cuando el pH se acidifica. El estado glóbulo fundido de los fragmentos N-terminales de Bap se caracteriza por poseer una estructura terciaria poco organizada. Sin embargo, cuando se organiza en laminas β tiene tendencia a polimerizar para formar fibras de tipo amiloide. La transición de Bap desde glóbulo fundido a lamina-β no ocurre en presencia de calcio. La unión del calcio a los dominios EF-hand presentes en la región N-terminal de Bap estabiliza la conformación de glóbulo fundido impidiendo la transición a lamina β y el subsecuente ensamblaje de las fibrillas amiloides. Estos resultados indican que Bap juega una doble función en el proceso de formación del biofilm, primero como sensor de condiciones ambientales externas, y segundo como modulo para la construcción de un andamiaje proteico que sustente la matriz del biofilm en determinadas situaciones ambientales. Este comportamiento multicelular dependiente de pH está conservado en proteínas Bap presentes en otros estafilococos coagulasa negativos. La existencia de proteínas homólogas a Bap en otras bacterias sugiere que este mecanismo de agregación amiloide como estrategia para formar la matriz del biofilm, está conservado en bacterias.
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Biología de plásmidos y dinámica génica en el complejo Pseudomonas syringae
(2017) Añorga García, Maite; Murillo Martínez, Jesús; Bardají Goikoetxea, Leire; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
La mayoría de las cepas de Pseudomonas syringae posee uno o más plásmidos nativos tipo PFP, que suelen albergar genes adaptativos y que facilitan el intercambio de los mismos entre poblaciones bacterianas. P. syringae pv. savastanoi NCPPB 3335 causa la tuberculosis del olivo (Olea europaea) y es un patógeno modelo para el estudio de la patogénesis bacteriana en plantas leñosas. Esta cepa contiene tres plásmidos PFP estables que han sido completamente secuenciados —pPsv48A, 80 kb; pPsv48B, 45 kb, y pPsv48C, 42 kb— y que portan varios posibles genes de virulencia. A pesar de la importancia de los plásmidos PFP en el ciclo de vida de P. syringae, todavía se desconocen muchos aspectos de su genética y biología, por lo que en esta Tesis nos hemos propuesto los siguientes objetivos: 1) identificación y caracterización funcional de un segundo origen de replicación presente en el plásmido nativo pPsv48C de Ps pv. savastanoi NCPPB 3335; 2) identificación de determinantes de mantenimiento presentes en los plásmidos de la cepa NCPPB 3335 y evaluación de su contribución al mantenimiento de dichos plásmidos, y 3) evaluación del papel del plásmido pPsv48C en la patogenicidad y virulencia de la cepa NCPPB 3335 en su interacción con su planta huésped, olivo. Hemos identificado un segundo replicón en pPsv48C, que es una quimera por compartir su región de control y promotor con el replicón no homólogo RepA-PFP. Hemos demostrado que este tipo de quimeras es frecuente en al menos cuatro familias de replicasas no homólogas de Pseudomonas, incluyendo bacterias patógenas de plantas, animales y humanos. Estos replicones constan de dos módulos funcionales e independientes correspondientes a las regiones de control (módulo REx-C), que actúa como determinante de incompatibilidad, y de replicación (módulo REx-R). Mediante ensayos funcionales, hemos determinado que los tres plásmidos de NCPPB 3335 utilizan diversas estrategias y mecanismos para aumentar su estabilidad. Así, la presencia de estos dos replicones, y especialmente del replicón RepJ, confiere una alta estabilidad a pPsv48C. Además, hemos documentado que los elementos repetitivos IS801 y MITEPsy2 generan frecuentes deleciones y reorganizaciones plasmídicas, cuya frecuencia se reduce por un factor entre 3 y 50 debido a la acción de tres sistemas toxina-antitoxina codificados en pPsv48A y otros tres codificados en pPsv48C. Asimismo, estos sistemas reducen en dos órdenes de magnitud la frecuencia de pérdida espontánea del plásmido pPsv48A y contribuyen al mantenimiento de los genes de virulencia ptz (en pPsv48A) e idi (en pPsv48C). Mediante inactivación funcional de los sistemas de mantenimiento de pPsv48C, hemos obtenido un derivado de NCPPB 3335 curado de sus tres plásmidos nativos (cepa UPN912), que no produce tumores en olivo. Mediante inoculaciones con esta cepa y con mutantes específicos hemos demostrado que el gen idi —que codifica una posible isopentenil difosfato isomersa y éstá probablemente implicado en la biosíntesis de citoquininas— es esencial para la producción de tumores de tamaño silvestre tanto en plantas micropropagadas como en olivos lignificados. En conjunto, nuestros resultados indican que la cepa NCPPB 3335 contiene tres plásmidos nativos de virulencia, que están expuestos a frecuentes eventos de reorganización genética cuyo efecto se ve contrarrestado por la existencia de múltiples determinantes plasmídicos de estabilidad, que a la vez contribuyen a disminuir la pérdida espontánea de los plásmidos y al mantenimiento de genes de virulencia durante el ciclo de vida de la bacteria.
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Genomic, transcriptomic and proteomic analysis of Pleurotus ostreatus secreted proteins
(2017) Alfaro Sánchez, Manuel; Pisabarro de Lucas, Gerardo; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena
The objective of this thesis is to study the proteins secreted by the edible and worldwide cultivated white rot basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus with three major goals: to determine the set of proteins secreted under different nutritional conditions, to determine the effect of the monokaryotic and dikaryotic mycelial conditions on the secretome, and to explore the relationship between the transcriptome of the secreted proteins and the actual secretome in different monokaryotic strains. In the first chapter of this thesis, we will review several basidiomycete secretome analyses comparing the results obtained using different analytical techniques and discussing some representative examples. We will pay a special attention to the lignocellulolytic enzymes secreted and to the different fungal lifestyles. This chapter is an updated version of the paper entitled Comparative analysis of secretomes in basidiomycete fungi that we published in Journal of Proteomics in 2014 as a summary of the state of the art. The main conclusions of this chapter are that a combination of genomic, transcriptomic and proteomics techniques is still the best approach for analyzing fungal secretomes, allowing to the identification of secretion patterns associated to the different lifestyles. In the third chapter, we screened two P. ostreatus monokaryotic genomes to identify bioinformatically the genes coding for proteins targeted for secretion. The study was made using the two monokaryotic protoclones (mkPC9 and mkPC15) whose genomes had been previously sequenced and annotated in a collaborative project carried out with the Joint Genome Institute. These two protoclones contain the two nuclei present in the commercial dikaryotic strains dkN001. The results obtained showed that, surprisingly, both strains differ in their lignocellulose degrading genomic capabilities. mkPC9 have less CAZy genes annotated, especially in the Glycosil hydrolases (GH) class. Nevertheless, mkPC9 grows better than mkPC15 on lignocellulosic substrates and has a higher enzyme secretion capacity when growing in the presence of wood. The transcription of the genes coding for secretable proteins was studied by RNAseq analysis and we could conclude that, whereas the genome profile of the secretome was similar in the two strains, the corresponding transcriptome profiles were different between them and in different culture conditions and we observed a concentrated transcriptional activity in few genes per function and an increased importance of the glycosil hydrolases and proteins without a functional classification. These results highlight the importance of adding additional data to the gene lists produced by genome sequence analysis for gaining a more accurate picture of the biological process under study. P. ostreatus secretes a huge variety of lignocellulose degrading enzymes when cultured in the presence of wood. More than 20% of them lack a known enzymatic function. Transcriptome analysis noted the importance of these proteins, further confirmed by proteomics. Using domain structure prediction, we were able to give an insight about the possible role of several proteins, including a xylanase and a AA10 LPMO. This chapter is a version of the manuscript entitled Comparative and transcriptional analysis of the predicted secretome in the lignocellulose‐degrading basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus published in Environmental Microbiology. Finally, in the fourth chapter, mass spectrometry analyses were used to confirm the presence of these enzymes acting on the lignocellulosic substrates. We compared the proteins secreted by the two monokaryons studied in the bioinformatics analysis with that of dikaryon that contains the two nuclei present in them. Interestingly, monokaryons behave in a very different manner; mkPC15 showed a weakest production of lignocellulose degrading enzymes than mkPC9 and dkN001 when cultured using wood as a carbon source. Moreover, dkN001 was able to secrete more plant cell wall decomposing enzymes, correlating with their superior capacity to grow on lignocellulosic substrates. Furthermore, the three strains were cultured in three different media using with glucose, wood or both (glucose and wood) as a carbon source. As expected, we identify a higher number of lignocellulose degrading enzymes in wood-containing media, especially glycosyl-hydrolases, carbohydrate esterases and polysaccharide lyases. Fungal lignocellulose degradation is the result of the synergistic action of several enzymes. These thesis improve our overall understanding of plant biomass degradation as a step to achieve the goal of using biomass as a sustainable source of energy to support future needs.
Open Access
Vertical transmission of the Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus and its application in biological control
(2016) Virto Garayoa, Cristina; Caballero Murillo, Primitivo; Murillo Pérez, Rosa; Williams, Trevor; Producción Agraria; Nekazaritza Ekoizpena; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa
Las infestaciones de larvas de Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) son muy frecuentes en los cultivos de pimiento de los invernaderos de Almería. En estudios previos, la caracterización molecular e identificación de los aislados del nucleopoliedrovirus múltiple de S. exigua (SeMNPV; Baculoviridae) con mayor potencial insecticida así como el desarrollo de otras tecnologías (producción masiva y formulación) permitieron la obtención de un bioinsecticida que es más efectivo que los plaguicidas químicos convencionales para combatir las plagas de S. exigua en las condiciones de dichos invernaderos. Las aplicaciones de formulados de baculovirus se han realizado principalmente utilizando la modalidad de suelta inundativa, en la cual sólo cabe esperar que ejerza un efecto de control el inóculo liberado. Sin embargo, tras la aplicación de un tratamiento con baculovirus, además de la mortalidad producida por el inóculo liberado, se producen otros efectos sobre las sucesivas generaciones del insecto cuya repercusión en la regulación de las plagas que causa han sido poco estudiados. En esta tesis, básicamente se han analizado y cuantificado algunas interacciones huésped-baculovirus y se aportan datos cualitativos y cuantitativos que pueden servir de base para definir una metodología intermedia entre las sueltas de tipo inundativo e inoculativo.