Tesis doctorales DABA - ABES Doktoretza tesiak
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Publication Embargo Bases para la exitosa implantación de sistemas de gestión de residuos orgánicos municipales(2024) Sánchez Arizmendiarrieta, Joseba; Irigoyen Iriarte, Ignacio; Plana, Ramón; Iso Tinoco, Andoni; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta ElikaduraLa generación de residuos municipales es una actividad inherente a la sociedad que tiende a incrementarse debido principalmente a la actividad humana, al ininterrumpido crecimiento de la población y al modelo de la economía lineal. Los materiales biodegradables son el componente mayoritario de los residuos municipales y, sin embargo los sistemas naturales son incapaces de reincorporarlos adecuadamente por encontrarse habitualmente mezclados con otros materiales. Otro de los retos actuales de la sociedad, es conseguir revertir la constante pérdida de fertilidad de los suelos como consecuencia en gran medida de la falta de materia orgánica edáfica, indispensable para el correcto “funcionamiento” del suelo y la perdurabilidad de los agrosistemas así como la mitigación del cambio climático reteniendo C orgánico en los suelos. Dada la problemática mundial en materia de generación y gestión de residuos municipales, se considera conveniente y necesario estudiar y mejorar la gestión de los residuos orgánicos municipales para reducir las pérdidas de materias primas, proteger el suelo, los ecosistemas, la salud de las personas y, a su vez, regenerar el clima. En este sentido, la Unión Europea está endureciendo cada vez más las obligaciones y restricciones impuestas por la legislación y estableciendo unos objetivos más ambiciosos y restrictivos en los Planes de Gestión de Residuos. Además, en Europa, los residuos orgánicos representan de media el 46% del total de residuos municipales y, según la Red Europea de Compostaje, sólo entre el 20 y el 60% del total de los residuos orgánicos municipales se recogen y tratan por separado. Evidentemente se trata de una fracción de residuos con amplio margen de mejora posible donde existe una gran variedad y diversidad de modelos de gestión exitosos, pero no una única opción que se adapte a todas las situaciones. Por lo tanto, es necesario el estudio individualizado de cada situación para poder establecer una gestión óptima y eficiente. Este trabajo, centrado en el ámbito territorial de la Comunidad Autónoma de Euskadi, analiza los aspectos clave de la gestión de los residuos orgánicos municipales para poder establecer una base adecuada que posibilite el diseño de los modelos para la gestión de los mismos más adecuado en cada zona. Para ello, tras analizar el marco normativo y estratégico de referencia y conceptualizar el concepto de residuo municipales, se presenta la situación actual y los resultados de su gestión, centrándose en las distintas alternativas implementadas en el territorio. Posteriormente se analiza la influencia de los sistemas de recogida selectiva de residuos municipales en la cantidad y calidad de las fracciones de los residuos domiciliarios recuperables para lo cual se comprueba el efecto que tienen los diferentes sistemas de recogida de residuos municipales en la cantidad y la composición de los residuos. A continuación se determina la tipología y el estado de las zonas de compostaje comunitario instaladas en la Comunidad Autónoma de Euskadi identificando a su vez los factores que afectan a la hora de que una instalación de compostaje comunitario tenga éxito o no. Por último, se evalúan los compost comerciales a escala industrial y los compost para el autoconsumo producidos en instalaciones de compostaje comunitario, realizando una comparativa entre ellos. A partir de los resultados obtenidos del primer estudio, se concluye que implementar un control en los sistemas de aporte y recogida de residuos, así como identificar al usuario mejoran los resultados de calidad de las diferentes fracciones y, simultáneamente, reducen la cantidad de los residuos desviados a vertedero. A su vez, se verifica que la capacitación de personal técnico es un factor clave para conseguir alcanzar el éxito a la hora de implementar un sistema de gestión de residuos orgánicos municipales basado en el compostaje comunitario. Por último se ha demostrado que el compost obtenido a partir del proceso de compostaje comunitario presentó una calidad superior al compost comercial. No obstante, para avalar y potenciar su difusión, sería interesante abordar en futuros estudios también aspectos sociales, demográficos, políticos, económicos y medioambientales asociados a estas prácticas.Publication Open Access Caracterización agronómica y ampelográfica de la serie RG de portainjertos de vid y estudio de las implicaciones de la calidad de la conexión del injerto sobre el comportamiento de la planta(2022) Marín Ederra, Diana; Santesteban García, Gonzaga; Torres Molina, Nazareth; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate PublikoaLa llegada a Europa de la filoxera de la vid hacia el año 1868 supuso una de las mayores crisis agrícolas de la historia, siendo el uso de portainjertos americanos tolerantes la única solución exitosa para detener su avance. La ingente cantidad de plantas necesarias para reconstruir el viñedo europeo provocó el desarrollo del sector de los viveros, que desde entonces provee a los viticultores de material de plantación. Esta tesis doctoral aborda dos retos que en la actualidad preocupan en mayor medida al sector viverístico: (i) la optimización de la elección de portainjertos y (ii) la mejora de la calidad fisiológica de las plantas injerto producidas. Específicamente, el primer reto se ha acometido desde dos perspectivas, la necesidad de ampliar el conocimiento de la influencia que tienen los portainjertos convencionales sobre las distintas variedades en distintas condiciones y, en segundo lugar, el desarrollo de nuevos portainjertos adecuados para las condiciones mediterráneas. El segundo reto se ha abordado a través del estudio de las implicaciones que tiene el alineamiento de la púa y la estaca en el momento de injertado sobre la tasa de éxito en vivero y sobre el comportamiento posterior de la planta. En relación con el uso de portainjertos convencionales, durante 4 anualidades (2015-2018) se realizó el seguimiento agronómico de las variedades Syrah y Tempranillo injertadas sobre 12 portainjertos convencionales, en un viñedo típico del Valle del Ebro establecido por el vivero Vitis Navarra en la localidad de Miranda de Arga (Navarra). Se realizaron medidas de crecimiento, producción y composición de la uva en vendimia, observando un claro efecto del portainjerto en el comportamiento agronómico de ambas variedades, con un impacto relevante en los parámetros de crecimiento y rendimiento, afectando consecuentemente a la madurez. En cuanto al desarrollo de nuevos portainjertos, se llevó a cabo la caracterización agronómica de 8 nuevos híbridos de la serie RG, obtenidos de la primera generación de un cruce entre los portainjertos 41 B MGt y 110 R como resultado de un programa de hibridación llevado a cabo por el vivero Vitis Navarra. La evaluación se llevó a cabo en una parcela en la que se disponía de las variedades Syrah y Tempranillo injertadas sobre dichos híbridos. Durante cuatro anualidades (2016-2019) se realizaron medidas de crecimiento, producción y composición de la uva, demostrando que un programa de hibridación basado en un cruzamiento sencillo permite obtener nuevos híbridos con interés agronómico y comercial. Los trabajos realizados en esta tesis, junto con otros llevados a cabo por el vivero y otras entidades, han permitido identificar candidatos muy prometedores y han promovido el registro de alguno de ellos, aumentando la variabilidad disponible para el sector. Finalmente, en relación con el segundo reto planteado, en esta tesis doctoral se ha abordado el estudio de las implicaciones que tiene el alineamiento de la púa y la estaca sobre (i) el comportamiento de las plantas en vivero, (ii) sus primeros años de implantación en viñedo y (iii) sobre su comportamiento hídrico e hidráulico en un ensayo en macetas. Los resultados obtenidos han subrayado la importancia de implantar buenas prácticas en el momento de injertado que permitan un buen alineamiento entre los individuos. Así, las plantas con alineación completa aumentaron notablemente la tasa de éxito en vivero y mostraron crecimientos superiores, tanto en el vivero como en su primer año de establecimiento en viñedo comercial y en maceta, aunque estas diferencias fueron desapareciendo con el paso de los años. Las plantas con alineación completa entre la púa y la estaca también presentaron mayor nivel de intercambio gaseoso foliar en el ensayo en maceta, pero tales diferencias no se vieron reflejadas en las medidas de conductividad hidráulica a través del injerto. Los resultados obtenidos a lo largo de esta tesis doctoral han permitido profundizar el conocimiento de la nueva serie RG de portainjertos previo a su posible introducción en el mercado y poner en evidencia la importancia de un buen alineamiento entre la púa y la estaca a la hora de realizar el injerto.Publication Embargo Carcass and meat quality of foals from Burguete and Jaca Navarra breeds raised under sustainable livestock systems in mountain landscapes. Development and innovation of new foal meat products(2023) Cittadini, Aurora; Sarriés Martínez, María Victoria; Lorenzo, José M.; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate PublikoaEsta tesis doctoral se centró en dos razas de potros autóctonas navarras en peligro de extinción, Jaca Navarra y Burguete, criadas en pastos de montaña, y finalizadas siguiendo dos dietas de engorde distintas. En concreto, en primer lugar, este trabajo pretendió estudiar el efecto de la raza, Jaca Navarra (JN) vs. Burguete (BU), y de la dieta de acabado, pienso convencional y paja (dieta 1 - D1) vs. silo y pienso ecológico (dieta 2 - D2), en los parámetros de crecimiento, características de la canal y calidad de la carne de cuarenta y seis potros. Además, el otro objetivo principal de esta Tesis fue encontrar y evaluar enfoques innovadores, centrados en la reformulación de la parte lipídica o de la cantidad de sal, para lograr cuatro productos cárnicos de potro más saludables, hamburguesa, salchichón, paté y cecina, sin alterar sus propiedades tecnológicas y sensoriales. Los resultados obtenidos en esta Tesis pueden contribuir a mejorar significativamente los conocimientos sobre la calidad de la canal y de la carne de dos razas de potros navarras en peligro de extinción, especialmente de la raza JN. Los datos indicaron la superioridad de los potros BU-D1 con respecto a los parámetros de crecimiento, las características de la canal y de la calidad de la carne en términos de contenido de grasa, luminosidad, veteado, terneza y jugosidad. No obstante, la D2 más fibrosa se destacó como alternativa prometedora a la convencional, ya que permitió un buen desarrollo de las características de la canal (aunque en menor medida), especialmente en los potros BU, así como la mejora de la calidad de la carne, en particular desde el punto de vista nutricional y aromático. Además, las prácticas ganaderas empleadas podrían conllevar efectos positivos a nivel social, económico y especialmente ambiental, confiriendo un valor adjunto a los productos finales. Por lo tanto, el perfil dietético y la imagen verde de esta carne, combinados con el uso de los potenciales sustitutos de la grasa animal o de la sal estudiados en la elaboración de los productos cárnicos, permitieron obtener productos finales con perfiles nutricionales mejorados sin alterar excesivamente sus propiedades tecnológicas y sensoriales en la mayoría de los casos, satisfaciendo las demandas de los consumidores modernos, así como las recomendaciones sanitarias.Publication Open Access Desarrollo de productos o ingredientes a partir de lulo (Solanum quitoense Lam.)(2023) González Bonilla, Sofía Marcela; Marín Arroyo, Remedios; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta ElikaduraEl objetivo general de esta tesis es obtener productos que permitan un mejor aprovechamiento del lulo, disminuyendo sus pérdidas por daños o pudrición y aumentando su valor comercial. En concreto se desarrollará un nuevo producto a base de lulo, consistente en una bebida en polvo rehidratada con agua para su consumo, más saludable que las opciones vendidas en el mercado actualmente, con la menor cantidad de ingredientes, sin azúcares añadidos, manteniendo cualidades nutricionales, funcionales y sensoriales de la fruta, procurando mejorar el aprovechamiento de la fruta y aceptado por el consumidor. Los objetivos espeíficos son: caracterizar los frutos y sus estados de maduración, determinando características fisicoquímicas, nutricionales y funcionales de los frutos. Establecer la formulación y las condiciones de elaboración de productos deshidratados de lulo, que permitan una mejor conservación, manteniendo la calidad nutricional y funcional; caracterizar fisicoquímica y sensorialmente los productos deshidratados obtenidos; determinar la aceptación/rechazo del nuevo producto, por los consumidores.Publication Open Access Desarrollo e innovación en procesos y productos a partir de los productos de las abejas(2023) López Patiño, Carmenza; Virseda Chamorro, Paloma; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta ElikaduraDentro de los productos de las abejas, la miel es la que más se conoce, se usa y se comercializa, por su poder edulcorante de origen natural; sin embargo, más allá de esta característica, cada vez crece más el interés por sus propiedades que permiten su uso en múltiples campos, uno de ellos, en el sector alimentario. Lo anterior gracias a los efectos de sus componentes minoritarios, tales como los compuestos bioactivos que le dan capacidad antioxidante, un común denominador en los productos apícolas. Así como en la miel, en los propóleos también se ha encontrado dicha capacidad, por lo que se hace interesante potenciar estos productos, mediante la búsqueda de alternativas de uso alimentario, dada la tendencia cada vez mayor hacia el uso de productos naturales como sustitutos de los sintéticos. En este sentido, el objetivo general de la presente tesis doctoral fue caracterizar mieles y propóleos, realizar seguimiento de sus parámetros de frescura a lo largo del tiempo y con base en sus resultados identificar procesos y productos innovadores que conduzcan al desarrollo de nuevas matrices alimentarias a partir de cada uno de ellos independientemente y en mezcla. Los compuestos más abundantes en la miel son los azúcares, gracias a los cuales es un producto relativamente estable con una vida útil de aproximadamente dos años en condiciones normales de temperatura < 30 °C, HR alrededor del 60%, protegida de exposición directa de la luz solar y envasada en vidrio. Pese a dicha estabilidad, la miel envejece y se deteriora con el tiempo, perdiendo sus propiedades y desarrollando sustancias que indican baja calidad, como lo son el hidroximetilfurfural (HMF). La actividad diastasa que es también un indicador de calidad, varía en función del origen botánico y del aporte que las abejas le hacen a la miel y con el tiempo se va reduciendo. La mayoría de las muestras de este estudio (76% para el contenido de HMF y 96% para AD) conservaron sus características de calidad después de 2 y 4 años de almacenamiento bajo condiciones controladas de temperatura (21 ± 2 °C) y 28% de humedad relativa. Aplicando altas presiones hidrostáticas (APH), se consiguió que el 90 % para el contenido de HMF y el 100% para AD de las muestras de este estudio cumplieran con los parámetros de calidad de la miel. De cara a buscar nuevas alternativas de uso de miel y propóleos, en los experimentos desarrollados se encontraron aplicaciones: En vegetales como la patata, donde el extracto de propóleos en combinación con el aceite esencial de menta, logró inhibir totalmente la germinación en almacenamiento a 8 °C en las dos variedades de patata (cv Monalisa y cv Jaerla) y una germinación menor al 20% en cv Jaerla almacenada a 25 °C durante 60 días. Así mismo, una combinación de miel (30% p/v y ácido ascórbico 0.05 % p/v) aplicada sobre patata mínimamente procesada y cortada en láminas, consiguió una inhibición de la PPO por encima del 90% y un efecto antioxidante con retardo de pardeamiento de la mezcla al evaluar pH, color y apreciación sensorial (textura, aspecto y olor) durante 14 días a 4 °C, por lo que se afirma que puede ser un antioxidante natural. En carne, se logró un efecto positivo sobre la calidad de carne de ternera fresca almacenada a 4 °C durante 14 días, demostrando las propiedades antioxidantes y antibacterianas en mesófilos y Enterobacterias de propóleos y mielato en mezcla (8 y 10 %, respectivamente) con lo cual se aduce podrían usarse como conservantes naturales. Así mismo, los experimentos donde se obtuvo miel pulverizada mediante liofilización, la mezcla de harina y miel al 50 % p/p fue la que mejores características de humedad e higroscopicidad presentó, por lo cual fue la que se utilizó para adicionar a la carne picada al 10 y 20 % p/p. Ralentización del crecimiento de Enterobacterias y aerobios mesófilos totales consiguieron los tratamientos aplicados, en mayor medida con mayor concentración de miel, pero el color de las muestras tratadas fue afectado con disminución para los parámetros L* y a*, durante 10 días de seguimiento, por lo que nuevos estudios que incluyan mayor cantidad de parámetros pueden plantearse con base en estos resultados.Publication Open Access Desarrollo y caracterización de recubrimientos comestibles antimicrobianos para la conservación de productos derivados de la pesca(2019) Otero Tuárez, Víctor Oswaldo; Maté Caballero, Juan Ignacio; Fernández Pan, Idoya; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate PublikoaCon el fin de mejorar la calidad microbiana y aumentar la vida útil de productos de pescado fresco, se propone el uso de películas y recubrimientos comestibles antimicrobianos como una tecnología emergente para complementar los procedimientos tradicionales de conservación empleados por la industria alimentaria. En primer lugar, se combinaron dos estrategias distintas para conservar medallones de merluza (Merluccius merluccius) en refrigeración: i) la aplicación de un recubrimiento antimicrobiano con aceite esencial de orégano o carvacrol y ii) la reducción de la carga microbiana inicial mediante buenas prácticas de manejo y un tratamiento superficial mediante hipoclorito de sodio. El uso de ambas estrategias combinadas dio lugar a una reducción de los recuentos de todos los grupos bacterianos después de 12 días de almacenamiento que osciló entre 1.5 log y 8 log en Pseudomonas y en bacterias sulfito reductoras, respectivamente. Por otra parte, nuevos agentes antimicrobianos fueron estudiados a nivel in vitro, incorporados en diferentes matrices formadoras de recubrimientos: proteína aislada de suero lácteo (WPI) y gelatina de pescado (GP). El arginato láurico (LAE) fue incorporado en las películas de GP en varias concentraciones. El LAE afectó al pH y la tensión superficial de la solución formadora de películas. La incorporación del LAE no afectó a las propiedades ópticas, ni a la humedad de las películas; pero sí a la solubilidad de las películas en agua. También afectó a las propiedades mecánicas de las películas, pero no a la permeabilidad al vapor de agua. Estas películas antimicrobianas, fueron más efectivas frente a las bacterias Gram-positivas que frente a las bacterias Gram-negativas. Otro agente estudiado fue el extracto de hinojo marino. Se evaluaron la capacidad antioxidante (CA) y el contenido total de polifenoles presentes en los extractos y su efecto en la incorporación en películas comestibles a base de WPI y GP. Para la obtención de los extractos se evaluaron dos métodos de secado: convencional mediante aire caliente y por liofilización. Las plantas deshidratadas fueron tratadas con dos concentraciones de etanol. Los extractos obtenidos mediante liofilización y alta concentración de etanol presentaron mayor concentración de polifenoles y alta CA. Se elaboraron películas activas con varias concentraciones de extracto y se evaluaron sus propiedades físicas, antioxidantes y antimicrobianas. El extracto agregado afectó a las propiedades físicas y mecánicas de las películas activas. Se observó CA de las películas mediante el método ABTS, pero no se presenció actividad antimicrobiana.Publication Open Access Effect of production factors on foal carcass and meat quality. Consumers preferences(2018) Ruiz Darbonnens, Marta; Beriain Apesteguía, María José; Sarriés Martínez, María Victoria; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta ElikaduraThis PhD thesis is part of a research project (INIA, RTA 2012-00090-C03-01) entitled “Influence of cross breeding with Burguete on the productive parameters and characteristics of the carcass and meat of the Galician foal. Ageing and commercial life of the meat” focused on the preservation of the Galician Mountain breed by crossing with Burguete foals. The general objective of the present PhD thesis was to study the quality along the foal meat production chain by means of the use of the carcass and the meat from 46 Galician Mountain x Burguete crossbred foals (GMxB foals).Publication Embargo Estrategias nutricionales para reducir las emisiones de metano de origen entérico en vacuno lechero: utilización del quitosano y de la torta de lino prensada en frío(2024) Rey Gotxi, Jagoba; García-Rodríguez, Aser; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta ElikaduraLas emisiones entéricas de metano plantean un problema grave para la producción de rumiantes y la sostenibilidad ambiental. Para mitigar las emisiones de metano, se han combinado esfuerzos de investigación en estrategias de manejo, alimentación y mejora genética de los animales. Sin embargo, para evaluar el efecto de cualquier estrategia nutricional sobre las emisiones entéricas de metano a nivel de granja es necesario implementar metodologías que permitan hacerlo. A partir de aquí, el objetivo general de esta tesis ha sido investigar diferentes estrategias nutricionales potencialmente capaces de reducir la producción de CH4 de origen entérico en vacas lecheras. Los objetivos específicos fueron: 1- comparar dos métodos no invasivos a gran escala para medir CH4: analizador de metano infrarrojo no dispersivo (NDIR) y el detector de metano láser portátil (LMD), 2- ampliar el conocimiento sobre la actividad y el modo de acción del CHI sobre la metanogénesis y las poblaciones microbianas del rumen in vivo y 3- describir los efectos de la suplementación dietética con torta de lino prensada en frío sobre los aspectos productivos, la metanogénesis y las poblaciones microbianas del rumen in vivo.Publication Embargo Estudio de heterorresistencia antibiótica, regulación epigenómica e inactivación génica programable durante la infección respiratoria por Haemophilus influenzae(2024) Gil Campillo, Celia; Garmendia García, Juncal; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta ElikaduraEste trabajo de Tesis Doctoral aborda tres aspectos clave en el estudio de la infección respiratoria por el patógeno oportunista Haemophilus influenzae, centrados en mecanismos alternativos a la resistencia antibiótica asociados al fallo terapeútico (Capítulo 1), la regulación epigenética de la expresión génica (Capítulo 2), y el desarrollo de herramientas de ingeniería genética innovadoras para estudios funcionales de genes bacterianos a escala genómica (Capítulo 3). H. influenzae está incluido en la Lista de Patógenos Prioritarios de la Organización Mundial de la Salud para los que el desarrollo de nuevos antimicrobianos se considera una prioridad sanitaria, en este caso debido a su resistencia creciente a ampicilina. Además de la resistencia, la heterorresistencia, tolerancia y persistencia antibiótica contribuyen al fallo terapéutico, y no son detectados mediante procedimientos estandarizados en la práctica clínica. El imipenem es un antibiótico carbapenémico útil en el tratamiento inicial-empírico de infecciones graves debido a su baja toxicidad y baja resistencia. La resistencia de H. influenzae a imipenen es poco frecuente, si bien la evidencia disponible sugiere que los niveles de heterorresistencia están infraestimados. En el Capítulo 1 de este Trabajo, evaluamos la resistencia, heterorresistencia y tolerancia a imipenem en una colección de cepas clínicas de H. influenzae aisladas de muestras respiratorias de pacientes que sufren Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC), y cuyos genomas habían sido previamente secuenciados. Mediante ensayos de tipo difusión en disco, Etest, TD-test y population analysis profiling identificamos un bajo nivel de resistencia, ausencia de tolerancia, y una proporción significativa de heterorresistencia a imipenem. Si bien buscamos rasgos genómicos responsables de la heterorresistencia observada mediante: i) análisis de la variación alélica de los genes ftsI, acrA, acrB y acrR, previamente asociados con heterorresistencia; ii) análisis de variación alélica a nivel genómico entre cepas pertenecientes al mismo tipo clonal pero fenotípicamente heterogéneas; y iii) análisis comparativo de distribución génica a nivel genómico en cepas susceptibles y heterorresistentes, no detectamos asociaciones significativas entre rasgos genéticos concretos y los fenotipos observados. En conjunto, mostramos que la heterorresistencia es un fenómeno con alta prevalencia, complejo y multifactorial, y destacamos la necesidad de implementar protocolos fáciles y rápidos para su identificación en la práctica clínica. Por otra parte, H. influenzae es una bacteria patobionte bien adaptada al ser humano, que provoca infecciones respiratorias en pacientes inmunocomprometidos que sufren, entre otras, EPOC. Los elementos reguladores que dictan la supervivencia y adaptación de H. influenzae en el pulmón de pacientes que sufren EPOC son poco conocidos. En γ-proteobacterias, el estado de metilación de motivos GATC localizados en regiones reguladoras modula la unión de la ARN polimerasa y de factores de transcripción, afectando la transcripción. En los genomas bacterianos, la mayoría de los motivos GATC se encuentran metilados por la metiltransferasa Dam, si bien existen sitios GATC que pueden permanecer no metilados o hemi-metilados si la actividad de Dam se encuentra bloqueada por la unión de proteínas al ADN. La combinación de motivos GATC metilados y hemi- o no metilados en regiones reguladoras o promotoras puede estar asociada a eventos de regulación epigenética de la expresión génica. En el Capítulo 2 de este Trabajo, analizamos la supervivencia de H. influenzae en un modelo pulmonar murino mediante mutagénesis por transposición a escala genómica acoplada a secuenciación profunda (Tn-seq), identificando la contribución de la metiltransferasa Dam en la supervivencia pulmonar de esta bacteria. El estudio del patrón de metilación por Dam a escala genómica mediante secuenciación en tiempo real de moléculas individuales (SMRT-sequencing), mostró motivos GATC no metilados o hemi-metilados en regiones reguladoras, lo que nos llevó a identificar el primer caso de variación fenotípica controlada por metilación Dam en una población de células isogénicas de H. influenzae. Además, la inactivación de dam y el estudio de su efecto a nivel transcriptómico, mediante secuenciación de ARN (RNA-seq) y análisis de expresión génica diferencial, reveló una nueva red regulatoria donde la metilación por Dam y los reguladores transcripcionales FNR y Fur regulan de manera coordinada la expresión de un panel de genes implicados en la defensa anaerobia de H. influenzae frente a especies reactivas de nitrógeno. Estos resultados tienen valor pato-adaptativo en nichos con estrés nitrosativo y baja oxigenación como son las vías respiratorias bajas de pacientes que sufren EPOC. Por último, H. influenzae fue el primer organismo de vida libre cuyo genoma completo fue secuenciado, siendo pionero en el desarrollo y empleo de técnologías -ómicas. Los métodos de secuenciación de inserción de transposones han sido útiles para realizar estudios de función génica e identificar genes esenciales en H. influenzae, si bien en su mayoría los genes que son considerados esenciales tienen funciones desconocidas dada la imposibilidad de generar mutantes. La tecnología de interferencia génica mediante CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat) acoplada a secuenciación profunda (CRISPRi-seq), solventa esta limitación permitiendo el escrutinio y análisis de genes esenciales a escala genómica mediante silenciamiento génico. En el Capítulo 3 de este Trabajo, desarrollamos una plataforma CRISPRi-seq inducible por anhidrotetraciclina para silenciamiento génico programable en H. influenzae a escala genómica, y validamos su utilidad y potencial, abriendo nuevas vías para la comprensión funcional del genoma de esta bacteria. En conjunto, el Trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral supone un avance significativo en el conocimiento de las bases moleculares de la infección por H. influenzae y presenta herramientas de ingeniería genética aplicables a la búsqueda de dianas terapeúticas para el desarrollo de estrategias que mejoren el manejo clínico de infecciones asociadas a este patógeno.Publication Embargo Estudio de infección policlonal, vida extracelular y adaptación metabólica de Haemophilus influenzae en el sistema respiratorio humano(2024) Asensio López, Javier; Garmendia García, Juncal; Burgui Erice, Saioa; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako GobernuaEste trabajo de Tesis Doctoral aborda tres aspectos de la interacción entre la bacteria Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano, considerando el desarrollo de herramientas genéticas de marcaje diferencial y su aplicación al estudio de infecciones policlonales (Capítulo 1), el potencial terapéutico anti-biofilm de moléculas derivadas de cinamaldehído (Capítulo 2), y el papel del triptófano y sus derivados en la modulación de la interacción hospedador-patógeno (Capítulo 3). Los procedimientos clínicos estandarizados para el tratamiento de infecciones bacterianas se basan en la identificación del patógeno causante y la determinación de su susceptibilidad antibiótica, a menudo utilizando bacterias aisladas a partir de una única colonia. En el caso de patógenos respiratorios, esta práctica puede ser cuestionable ya que los pacientes crónicos pueden estar simultáneamente colonizados por clones distintos de un mismo patógeno, con características genotípicas y fenotípicas diferentes que pueden conducir a diferentes perfiles de susceptibilidad antibiótica. Esta heterogeneidad es detectada en aislados de H. influenzae obtenidos a partir de muestras respiratorias de pacientes respiratorios crónicos, cuyos diferentes perfiles de susceptibilidad antibiótica pueden provocar fallo terapéutico en la práctica clínica. En el Capítulo 1 de este Trabajo, generamos una colección de plásmidos modulares que permiten el marcaje diferencial de cepas de H. influenzae. Empleando este marcaje diferencial, estudiamos la formación de biofilm mixtos formados por dos cepas de H. influenzae genéticamente distintas, con diferente capacidad de formación de biofilm y susceptibilidad antibiótica, mostrando la acción selectiva de los antibióticos en estos biofilms policlonales. Además, estudiamos la dinámica de co-infección epitelial por dos cepas de H. influenzae, mostrando la localización intracelular de cepas con distinta capacidad invasiva. Este panel de herramientas abre el camino al estudio de comunidades bacterianas policlonales y polimicrobianas en las que participa H. influenzae. Por otra parte, patologías respiratorias crónicas como la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) facilitan el acceso pulmonar de H. influenzae, que persiste formando biofilms, un estilo de vida protector frente al sistema inmune y tratamientos antibióticos, que cronifica la infección y facilita la aparición de resistencias. H. influenzae está incluido en la Lista de Patógenos Prioritarios de la Organización Mundial de la Salud por su resistencia a ampicilina, resultando prioritario el desarrollo de nuevos antimicrobianos y la estandarización de métodos de evaluación de eficacia de fármacos anti-biofilm. En el Capítulo 2 de este Trabajo, presentamos un panel de protocolos para el análisis sistemático de fármacos anti-biofilm. Como prueba de concepto, evaluamos el efecto antimicrobiano de moléculas derivadas del cinamaldehído frente a cepas de H. influenzae con distinta capacidad de formación de biofilm. Observamos que (E)-Trans-2- nonenal y (E)-3-Decen-2-ona inhiben la formación de biofilms y erradican biofilms preformados por H. influenzae. Además, la baja toxicidad de (E)-Trans-2-nonenal llevó a su selección para encapsulación en nanopartículas poliméricas, que permiten una mayor solubilidad manteniendo el efecto anti-biofilm, y pueden ser útiles para una liberación controlada y segura de fármacos. Por último, H. influenzae dispone de mecanismos pato-adaptativos entre los que se encuentra la evasión de la inmunidad nutricional. El triptófano (Trp) es un metabolito esencial para esta bacteria, que sintetiza su propio Trp y capta Trp exógeno a través de al menos dos sistemas de transporte. Por su parte, el hospedador restringe la disponibilidad de Trp a través de la acción de la enzima indolamina 2,3 dioxigenasa IDO, que cataboliza Trp generando kineurinas que, junto a otros derivados de Trp, son ligandos del receptor de hidrocarburos de arilos AhR. IDO y AhR participan en el control de la respuesta inmune y el mantenimiento de la homeostasis pulmonar. En el Capítulo 3 de este Trabajo, analizamos el efecto de la disponibilidad de Trp exógeno y endógeno en la fisiología e infección respiratoria por H. influenzae. Así mismo, analizamos cómo la disponibilidad de Trp en el sistema respiratorio influye en la interacción hospedador-patógeno, mostrando que el Trp y sus derivados modifican la expresión de IDO, AhR y sus efectores, modulando la respuesta del hospedador frente a la infección por H. influenzae. En conjunto, el Trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral supone un avance significativo en el conocimiento de las bases moleculares de la interacción entre H. influenzae y el sistema respiratorio humano, lo que puede ser de utilidad en el desarrollo de estrategias que mejoren el manejo clínico de enfermedades asociadas a este patógeno.Publication Open Access Estudio del sistema Wzm/Wzt en Brucella y evaluación del candidato vacunal Rev1∆wzm frente a la brucelosis ovina(2023) Mena Bueno, Sara; Grilló Dolset, María Jesús; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate PublikoaLa brucelosis es una enfermedad zoonótica causada por bacterias del género Brucella que, además, conlleva grandes pérdidas económicas. La principal fuente de infección para el ser humano son los rumiantes, en los que la enfermedad cursa con aborto y otras alteraciones reproductivas. En la mayoría de las regiones afectadas, la vacunación de los animales es la única estrategia realista para controlar la infección. La cepa atenuada B. melitensis Rev1 es la única vacuna recomendada frente a la brucelosis ovina y caprina, pero posee ciertos inconvenientes, entre los que destacan la virulencia en ovejas gestantes, la interferencia serológica que generan, la posibilidad de infectar al ser humano y la resistencia a los tratamientos con estreptomicina, que instan la búsqueda de nuevas vacunas. El lipopolisacárido liso (S-LPS) de Brucella es un conocido factor de virulencia y también el antígeno inmunodominante en las pruebas de diagnóstico, por lo que sus distintas modificaciones representan una interesante aproximación en la búsqueda de una vacuna segura. Entre las rutas de biosíntesis del S-LPS, el sistema de dos componentes Wzm/Wzt es el responsable de transportar el O-PS sintetizado en la cara citoplasmática de la membrana interna hasta el espacio periplasmático, para su posterior ensamblaje al core-lípido A para formar el S-LPS. El bloqueo de esta ruta conlleva la creación de mutantes con LPS rugoso (R-LPS) capaces de acumular un O-PS dentro de las bacterias que puede ser decisivo para generar una respuesta inmune efectiva frente a la infección. Sin embargo, aún se desconocen las implicaciones biológicas de cada proteína del transportador. En particular, el bloqueo del O-PS podría acarrear modificaciones en la envuelta bacteriana, ya que su transporte requiere la participación del bactoprenol como molécula portadora, el cual también está involucrado en la biosíntesis de otras estructuras celulares. Con el objetivo de profundizar en el conocimiento de este sistema transportador de Brucella y su potencial aplicación en el desarrollo de vacunas, en el capítulo 1 de esta tesis se presenta la construcción y caracterización de mutantes Δwzm/Δwzt simples y doble derivados de Rev1. Además, con fines comparativos, se construyeron mutantes ∆wzm derivados de B. abortus 2308 y S19, y se utilizó un mutante 16M∆wzm derivado de la cepa virulenta B. melitensis 16M previamente desarrollado en el grupo de Sanidad Animal del Instituto de Agrobiotecnología (IdAB). Como resultado, los mutantes carentes de O-PS externo exhibieron cambios de expresión génica, propiedades antigénicas del O-PS interno y cambios fenotípicos asociados a modificaciones de la membrana externa y/o de la pared celular. Además, los mutantes Rev1 ∆wzm/∆wzt fueron muy susceptibles tanto a polimixinas como a los antibióticos utilizados para el tratamiento de la brucelosis humana, en particular, a la estreptomicina; y mostraron una gran atenuación en ratón. Entre ellos, Rev1∆wzm destacó por inducir un pico de esplenomegalia transitoria, ser altamente inmunogénico y generar una protección eficaz frente a la infección virulenta por B. melitensis y por B. ovis en el modelo murino. En el capítulo 2, antes de estudiar la seguridad de Rev1∆wzm en su hospedador natural, se determinó la capacidad de este candidato vacunal para crecer en los medios de cultivo selectivos Farrell (FM) y CITA (CM), actualmente recomendados para el aislamiento primario de Brucella. La fuerte susceptibilidad del mutante a las polimixinas y la sinergia observada entre colistina y vancomicina conllevaron una severa inhibición de este candidato vacunal en ambos medios selectivos. Para resolverlo, se reformuló y evaluó el denominado Brucella Selective Medium (BSM) que, tras su evaluación con más de 1.700 muestras ovinas de campo, demostró ser capaz de mejorar el rendimiento de los medios anteriores. Además, profundizando en la productividad de BSM para otras brucellae, se observó que tanto BSM como CM inhibían el crecimiento de una colección de cepas B. abortus bv1. El análisis de las posibles causas llevó al desarrollo un segundo medio selectivo denominado Brucella Selective Improved Culture (BruSIC) que resultó permisivo para todas las cepas de Brucella analizadas y tan inhibidor como CM para las bacterias contaminantes habituales en muestras veterinarias. BruSIC ofrece la ventaja adicional de no precisar suero bovino para el aislamiento de cepas de Brucella suero-dependientes, lo que simplifica la preparación del medio, abarata costes y evita el uso de compuestos de origen animal. En el capítulo 3, se analizó la seguridad y respuesta inmune inducidas en corderos inoculados con Rev1∆wzm, demostrando que se activa la formación de anticuerpos sin interferir en las pruebas serológicas estándar para el diagnóstico de la brucelosis. Estos resultados, más otros logrados por el grupo de investigación en ganado adulto y en ovejas gestantes, hacen de este mutante un prometedor candidato vacunal para el control de la infección por B. melitensis y B. ovis en pequeños rumiantes. El contenido de estos tres capítulos de tesis ha sido publicado en las revistas científicas Frontiers in Microbiology (grupo Frontiers) y Microbiology Spectrum (ASM).Publication Open Access Estudios de patogénesis placentaria por Brucella y caracterización molecular de Brucella suis bv2(2022) Poveda Urkixo, Irati; Grilló Dolset, María Jesús; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako GobernuaLa brucelosis es una zoonosis mundialmente extendida con importantes repercusiones económicas y sanitarias tanto para la ganadería como para el ser humano. Existen doce especies distintas de Brucella con distinta preferencia de hospedador; entre ellas, B. melitensis (bovino), B. abortus (pequeños rumiantes) y B. suis (porcino) son las más frecuentes en el ganado doméstico, y a excepción de B. suis bv2, suponen un grave riesgo para el ser humano. La vacunación de los animales es una herramienta esencial para reducir la infección en los mismos y, así, evitar la transmisión al ser humano. La infección en pequeños rumiantes es ocasionada por las especies Brucella melitensis y B. ovis; la primera de ellas produce abortos a final de gestación en hembras gestantes y la segunda, orquitis y epididimitis en machos con la consecuente reducción de la fertilidad. La cepa atenuada B. melitensisRev1 es la única vacuna recomendada desde hace más de 60 años contra la brucelosis en pequeños rumiantes. Pese a su extendido empleo y demostrada eficacia, Rev1 posee ciertos inconvenientes que recomiendan la búsqueda de una vacuna alternativa más segura que, idealmente, pueda aplicarse en animales gestantes. En este contexto, en el grupo de Brucelosis del IdAB-CSIC, se han desarrollado dos candidatos de Brucella melitensis mediante deleción en fase del gen wzm (16MΔwzmy Rev1Δwzm) involucrado en el sistema de dos componentes Wzm/Wztr es responsable de la exportación del polisacárido O al periplasma bacteriano para completar la biosíntesis del LPS liso. En los Capítulos 1 y 2 de esta Tesis Doctoral, se ha estudiado la seguridad, respuesta inmune y patogénesis placentaria de ambos candidatos vacunales, tanto en modelos preclínicos (i.e. cultivos de células trofoblásticas y ratona gestante) como en ganado ovino de distintos sexos y en distintos tercios de la gestación. Además, se han realizado estudios novedosos de patogénesis placentaria y respuesta inmune a lo largo de la gestación en ratonas inoculadas con distintas cepas de referencia de Brucella como son B. melitensis16M (virulenta) y Rev1 (atenuada) y B. ovis PA. Los principales resultados del Capítulo 1 indicaron que, en comparación con sus parentales, ambos mutantes rugosos poseían menor capacidad de invasión, replicación y efecto citotóxico en trofoblastos BeWo, menor capacidad de colonización placentaria en ratones con resolución de la infección a este nivel en los últimos estadíos de la gestación, ausencia de lesiones placentarias y elevada viabilidad fetal, así como menor respuesta proinflamatoria a lo largo de la gestación murina. En el Capítulo 2, ambos mutantes mostraron atenuación y buena respuesta serológica en carneros, ovejas no gestantes y ovejas gestantes inoculadas por las vías subcutánea o conjuntival, en distintos tercios de gestación. Aunque ninguno de los candidatos indujo abortos, Rev1∆wzmse consideró más seguro que 16M∆wzmpara ovejas gestantes, puesto que este último mostró una reactivación de la infección en el momento del parto, que conllevó la excreción transitoria por placenta/fluido vaginal y/o leche en algunos animales. En conjunto, los Capítulos 1 y 2 nos han permitido establecer una relación entre la multiplicación de Brucella en trofoblastos BeWo y placentas murinas, y su capacidad para inducir abortos y transmitirse a la descendencia en ovejas inoculadas a mitad de gestación. Asimismo, pese a la gran utilidad del modelo de ratona gestante para seleccionar candidatos más seguros, la evaluación final de ciertos parámetros de seguridad debe realizarse en el hospedador natural. Futuros ensayos de eficacia y respuesta inmune en ovino permitirán determinar la utilidad real de Rev1∆wzm, como alternativa a la actual vacuna Rev1.Trascomprobar las buenas propiedades vacunales de Rev1∆wzm, en el Capítulo 3 de esta Tesis se propuso construir un mutante en B. suis bv2 para abordar la lucha contra la brucelosis porcina, mediante la construcción y caracterización de Bs2Δwzm. Este mutante mostró propiedades bioquímicas distintas a 16M∆wzmo Rev1∆wzm, así como menor atenuación de la esperada. Durante estos estudios, detectamos que la cepa parental Bs2 presentaba una marcada inestabilidad de fase L→R no reportada anteriormente. Además, aplicando el modelo de ratona gestante puesto a punto en el Capítulo 1, estudiamos la patogénesis placentaria y respuesta inmune de Bs2 a lo largo de la gestación en ratonas. Por lo tanto, este Capítulo 3 se completó con un detallado análisis genético y fenotípico de la cepa Bs2, con el objetivo de determinar el alcance de dicha inestabilidad de fase tanto in vitro como in vivo, y las bases moleculares responsables de la misma. Los principales resultados indicaron que, en ausencia de escisiones o mutaciones en las regiones genéticas wboy wbk portadoras de genes implicados en la biosíntesis del LPS, este fenómeno podría deberse a variaciones en la expresión bacteriana, en función de las condiciones ambientales. De hecho, los cultivos con un elevado grado de disociación bacteriana mostraron una reducción significativa de la expresión de los genes codificantes de distintas manosil-y glicosil-transferasas, junto con un aumento de la expresión de la proteína de membrana externa Omp2b. Debido a su complejidad, en esta Tesis no ha sido posible determinar con exactitud los mecanismos moleculares implicados en la disociación espontánea de B. suisbv2, por lo que son necesarios más estudios que permitan comprender estos mecanismos, su implicación biológica, y con ello, construir una cepa B. suisbv2 estable sobre la que poder obtener candidatos vacunales adecuados frente a la brucelosis porcina. Uno de los resultados más interesantes de esta Tesis Doctoral ha sido evidenciar, por primera vez, que la disociación de Bs2 observada in vitro tiene una implicación in vivo, encontrando en un mismo animal bacterias con fenotipos lisos en tejidos placentarios y rugosos en tejidos esplénicos de ratones. Futuros estudios en cerdas gestantes permitirán dilucidar si este fenómeno de adaptación bacteriana ocurre también en el hospedador natural.Publication Open Access Evaluación del interés del uso de una cubierta vegetal bajo la línea como estrategia de gestión del suelo en viñedos cultivados en condiciones de clima mediterráneo(2022) Abad Zamora, Francisco Javier; Santesteban García, Gonzaga; Orcaray Echeverría, Luis; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta ElikaduraEl manejo del suelo de los viñedos en condiciones de clima mediterráneo siempre ha primado reducir la competencia que pudieran generar otras plantas por los recursos nutricionales y, en especial, por los recursos hídricos. Sin embargo, los cambios de sistemas de producción, con desplazamiento de los viñedos a terrenos más fértiles, muchas veces dotadas de riego; la necesidad de buscar alternativas a los herbicidas como elementos de control de la vegetación adventicia, en especial en la zona ubicada bajo las cepas; plantean la posibilidad, o incluso la necesidad, de trabajar el suelo de manera diferente. En los últimos años, se ha avanzado de manera relevante en el estudio de las implicaciones del introducir las cubiertas vegetales como alternativa al uso de herbicidas y al laboreo, habiendo quedado de manifiesto el interés agronómico y ambiental de este cambio de manejo, que, como cualquier otro, debe acometerse considerando todas sus implicaciones en función de las particularidades de cada viñedo y objetivo agronómico-empresarial. Sin embargo, la práctica totalidad de las actuaciones encaminadas a introducir el uso de cubiertas en viñedos de zonas mediterráneas implican un cambio de gestión del suelo las calles, pero no del suelo bajo la línea de cultivo. En este contexto, la posibilidad de emplear una cubierta vegetal bajo la línea de cultivo que permitiera competir con otras adventicias pero no lo hiciera de manera relevante con el viñedo podría ser una alternativa de mucho interés. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado el comportamiento de una cubierta de T. fragiferum (UV) frente a un manejo con laboreo intercepas (T). Dicho ensayo se realizó durante tres campañas consecutivas (2018, 2019 y 2020) en un viñedo de Merlot ubicado en terrenos de Bodegas Ochoa en Traibuenas (Navarra-España), sobre un suelo Typic Calcixerepts y con un clima húmedo-templado mediterráneo según la clasificación de Papadakis. El conjunto de los resultados obtenidos permite concluir que el empleo de una cubierta de T. fragiferum bajo la línea de cultivo del viñedo en condiciones de clima mediterráneo constituye una alternativa realista al uso de herbicidas o laboreos intercepas. En las condiciones de ensayo, su uso ha redundado en una mejoría notable de los parámetros de calidad del suelo, sin apenas alterar el comportamiento agronómico y enológico de las cepas, resultando económicamente viable cuando se consigue una supervivencia de la cubierta mínima de tres años.Publication Open Access La expansión de Brachypodium rupestre en el Pirineo occidental: hongos endófitos y pérdida de servicios ecosistémicos(2022) Durán Lázaro, María; Canals Tresserras, Rosa María; San Emeterio Garciandía, Leticia; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate Publikoa; Gobierno de Navarra / Nafarroako GobernuaEn esta tesis se plantean dos líneas de investigación que han quedado recogidas en los tres trabajos científicos que la conforman: • Capítulo 1) La primera línea de investigación desarrolla un modo de cuantificar económicamente la pérdida del servicio ecosistémico de aprovisionamiento ligado a la expansión de B. rupestre, con el objetivo de sensibilizar a los sectores implicados y fomentar acciones medioambientales dirigidas a promover la conservación de los pastos de montaña, ecosistemas ambiental y económicamente valiosos. Para ello, se realizó una adaptación del método de valoración económica por sustitución y se llevaron a cabo inventarios florísticos en cubiertas de alta y baja diversidad florística. El registro de estos datos nos permitió generar unos valores pastorales transformables en cantidad de forraje disponible para los animales, tras un detallado cálculo de la superficie viable de ser pastada (200,05 ha tras excluir las zonas con grandes pendientes). Con censos de animales y con información detallada y exhaustiva del consumo de energía que tiene cada tipo de animal que pasta las estivas del valle (ovejas, vacas y caballos) se determinaron las raciones de alimento necesarias en una temporada de pastoreo estival (50007 raciones) y su coste monetario (21146€; 107€/ha). De este modo, se estimó el coste que supone la pérdida del valor de aprovisionamiento debido a la expansión de B. rupestre y que va ligado en este caso a la pérdida de riqueza y diversidad florística de las comunidades vegetales que lo constituyen. • Capítulo 2 y 3) La segunda línea de investigación engloba dos trabajos en los que se caracteriza la desconocida comunidad de hongos endófitos de individuos de B. rupestre desarrollándose en comunidades de alta y baja diversidad florística. El estudio de los microorganismos en su ambiente natural es una disciplina relativamente nueva, dado que su interés se ha centrado tradicionalmente en las enfermedades que afectan a los humanos, los animales o las plantas. Sin embargo, los grandes avances tecnológicos y científicos de las últimas décadas nos están permitiendo conocer su altísima diversidad y las complejas redes ecológicas en las que están involucrados. El conocimiento sobre los hongos endófitos, que crecen en el interior de casi todas las plantas sin desarrollar enfermedades, está demostrando numerosas ventajas adaptativas que estos pueden llegar a conferir a su huésped ante numerosas situaciones de estrés (salinidad, herbivorismo, patógenos, etc.).Publication Open Access Genetic diversity in Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus and factors involved in its generation(2021) Aguirre Sánchez, Eduardo; Caballero Murillo, Primitivo; Beperet Arive, Inés; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Universidad Pública de Navarra / Nafarroako Unibertsitate PublikoaEn la presente tesis se ha examinado la variabilidad genética de varios aislados de campo del nucleopoliedrovirus de Chrysodeixis includens (ChinNPV). Los resultados obtenidos revelan la gran variabilidad presente en los aislados naturales de ChinNPV, confirma las diferencias existentes entre dos variantes genotípicas procedentes de esos aislados y, lo más importante, parecen identificar a la variante ChinNPV-K como generadora de variabilidad en esos aislados. En conclusión, hemos encontrado una gran variabilidad en aislados naturales de ChinNPV, con una sola variante que muestra un papel clave en la generación de esta diversidad de manera dependiente de la concentración.Publication Embargo Host-virus and virus-virus interactions in broad host range alphabaculoviruses: implications for the development of virus-based insecticides(2021) Belda García, Isabel María; Caballero Murillo, Primitivo; Beperet Arive, Inés; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta ElikaduraEsta tesis se ha centrado en el estudio del potencial insecticida del nucleopoliedrovirus múltiple de Mamestra brassicae (MbMNPV), un virus de amplio espectro, y su interacción con el nucleopoliedrovirus múltiple de Helicoverpa armigera (HearMNPV) durante la coinfección en un huésped común. Los resultados obtenidos aportan un mejor entendimiento de las interacciones que se establecen entre diferentes virus y entre virus y huéspedes en alphabaculovirus de amplio espectro, lo cual podría ayudar a definir estrategias eficaces para el control de plagas de interés agronómico. En primer lugar, se evaluó la actividad insecticida y la estabilidad de dos aislados silvestres de alphabaculovirus altamente relacionados filogenéticamente, el HearMNPV y el MbMNPV derivado del bioinsecticida Mamestrin®, en un huésped permisivo (Spodoptera exigua) y uno semipermisivo (Spodoptera littoralis). Tras ello, se estudió la estructura genética del MbMNPV derivado del insecticida biológico Mamestrin® con el objetivo de evaluar las propiedades insecticidas de las variantes genotípicas que componen este aislado. Por último, se analizaron las interacciones que ocurren entre dos virus filogenéticamente cercanos cuando coinfectan a un huésped permisivo. En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis contribuyen a un mejor entendimiento de las interacciones que se establecen entre virus y huéspedes, lo cual puede ayudar al desarrollo de insecticidas basados en baculovirus y diseñar estrategias eficaces para el control de complejos de plagas de lepidópteros.Publication Open Access Identificación de lentivirus de pequeños rumiantes en granulomas post-vacunales y evaluación de métodos de diagnóstico y selección genética en la lucha frente a la infección(2021) Echeverría Garín, Irache; Reina Arias, Ramsés; Andrés Cara, Damián de; Glaría Ezquer, Idoia; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako GobernuaEsta tesis plantea tres objetivos que se desarrollarán en tres capítulos independientes, correspondientes a sus respectivas publicaciones. Por un lado, se ha caracterizado la presencia y replicación de SRLV en macrófagos procedentes de granulomas inducidos tras la vacunación con formulaciones basadas en hidróxido de aluminio, el adyuvante más común en las vacunas ovinas. En segundo lugar, se ha analizado una población de más de 1000 individuos en diferentes sistemas de producción y razas e infectados por diferentes cepas de SRLV. Se ha realizado un estudio serológico y molecular con las herramientas disponibles en el comercio y se ha analizado la asociación de parámetros productivos, en granjas de carne y leche, con la presencia de infección. Por último, se han analizado poblaciones ovinas correspondientes a cuatro razas de importancia productiva teniendo en cuenta su estado sanitario y el genotipo de la proteína TMEM154, uno de los candidatos más prometedores para su implantación en programas de selección genética.Publication Open Access Identification and quantification of crystal components of Bacillus thuringiensis strains and their contribution to insecticidal activity(2019) Caballero Sánchez, Javier; Caballero Murillo, Primitivo; Ancín Azpilicueta, Carmen; Jiménez Moreno, Nerea; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Ciencias; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; ZientziakEl principal objetivo de esta tesis ha sido desarrollar un método proteómico que permite analizar cualitativa y cuantitativamente las proteínas que componen el cristal producido por distintas cepas silvestres de Bt. El método emplea un sistema de cromatografía líquida acoplada a un espectro de masas (LC-MS/MS) en combinación con una monitorización de múltiples reacciones (MRM). Para llevar a cabo el análisis, es necesario conocer la secuencia del genoma de la cepa Bt para determinar los potenciales genes insecticidas que podrían formar parte del cristal parasporal. El uso de herramientas bioinformáticas permite la selección de péptidos proteotípicos que detectan de forma específica la presencia de cada una de las proteínas de la mezcla. Estos péptidos proteotípicos, marcados isotópicamente, permiten determinar la proporción relativa de cada proteína en el cristal. El método fue validado utilizando dos mezclas artificiales de tres proteínas recombinantes (Cry1Aa, Cry2Aa y Cry6Aa), donde la proporción relativa de cada proteína era conocida. La aplicación del método permitió detectar las tres proteínas de forma independiente y cuantificar la proporción relativa de cada una de ellas con gran fiabilidad y precisión. Una vez verificada su validez, el método fue aplicado para determinar la composición del cristal de cuatro cepas Bt silvestres que component el ingrediente activo de los productos comerciales más vendidos a nivel mundial para el control de distintos órdenes de insecto: DiPel® y XenTari® para lepidópteros, VectoBac® para dípteros, y Novodor® para coleópteros. El cristal parasporal de la cepa ser. kurstaki ABTS-351 (DiPel®) resultó estar compuesto por cuatro proteínas: Cry1Aa (13-22%), Cry1Ab (16-29%), Cry1Ac (6-12%) y Cry2Aa (40-64%); al igual que la cepa ser. aizawai ABTS-1857 (XenTari®) Cry1Aa (26-33%), Cry1Ab (57-60%), Cry1Ca (7-11%) y Cry1Da (3-4%). La cepa AM65-52 (VectoBac®) sintetizó un cristal formado por Cry4Aa (2-4%), Cry4Ba (10-28%), Cry11Aa (10-27%), Cry60Aa (2-4%), Cry60Ba (5-12%) y Cyt1Aa (38-61%) y el ingrediente activo de Novodor®, la cepa ser. tenebrionis NB-176, contenía Cry3Aa (70-75%), Cry23Aa (14-16%) y Cry37Aa (10-14%). Adicionalmente, se determinó la actividad de la cepa ABTS-1857 en larvas de tres especies del género Spodoptera: S. exigua, S. littoralis y S. frugiperda. S. exigua fue la especie más susceptible (CL50= 7.8 ng/μl), seguida de S. littoralis (CL50= 28 ng/μl). S. frugiperda se mostró como la especie más tolerante (CL50= 120.2 ng/μl). Para determinar la contribución de cada proteína individual a la toxicidad general de la cepa ABTS-1857 contra cada una de las tres especies de insectos, se construyeron cepas Bt recombinantes que producían individualmente las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ca y Cry1Da. Los resultados de los bioensayos, utilizando el “droplet feeding method”, revelarón una elevada toxicidad de Cry1Ca para las larvas de S. exigua y S. littoralis y de Cry1Da frente a S. littoralis y S. frugiperda. Las mezclas artificiales de dos o tres proteínas produjeron mortalidades atribuibles a la cantidad de Cry1Ca, en el caso de S. exigua, de Cry1Ca y Cry1Da, en el caso de S. littoralis, y de Cry1Da en el caso de S. frugiperda. La mezcla artificial de cuatro proteínas, que reflejaba la composición natural del cristal, dio valores de actividad concordantes con los producidos por el cristal natural de la cepa ABTS-1857. Aumentos de la proteína Cry1Da, en detrimento de las proteías Cry1Aa y Cry1Ab, produjo incrementos en la actividad insecticida para larvas de S. littoralis y S. frugiperda. Estos resultados indicaron que la metodología empleada para el análisis de los cristales es válida para su empleo en la caracterización y estandarización de los productos comerciales basados en Bt, aportando la información necesaria para expresar su potencia insecticida.Publication Open Access Implicación del metabolismo bacteriano en la interacción de Haemophilus influenzae con el sistema respiratorio humano: bases moleculares y explotación terapéutica(2022) López López, Nahikari; Garmendia García, Juncal; Díez Martínez, Roberto; Gobierno de Navarra / Nafarroako Gobernua, referencia 0011-1408-2017-000000Este trabajo de Tesis Doctoral aborda el papel de tres aspectos del metabolismo bacteriano (síntesis de purinas, catabolismo de glucosa, síntesis de ácidos grasos) en la interacción entre el patógeno Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano. Mediante análisis de expresión génica global, inactivación génica y caracterización fenotípica in vitro e in vivo, modelado computacional, química médica, y evaluación antimicrobiana a nivel preclínico, estudiamos los perfiles transcripcionales de patógeno y hospedador durante la infección respiratoria (Capítulo 2), la contribución del catabolismo de glucosa en la patogénesis de H. influenzae (Capítulo 3), y el potencial antimicrobiano de la inhibición de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos de esta bacteria (Capítulo 4). H. influenzae fue el primer organismo de vida libre cuyo genoma completo fue secuenciado, haciéndolo pionero en el desarrollo y empleo de técnicas -ómicas. El Capítulo 1 de este trabajo ha revisado la contribución de abordajes -ómicos incluyendo genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica, al estudio de la interacción entre HiNT y el sistema respiratorio humano. En el Capítulo 2 de este trabajo realizamos un estudio multi-ómico in vivo, consistente en la utilización de RNA-seq dual y Tn-seq durante el proceso de infección respiratoria murina por HiNT. El perfil de expresión génica diferencial entre bacterias cultivadas in vitro y bacterias recuperadas de lavado broncoalveolar murino mostró la sobre-expresión de genes que codifican enzimas implicadas en la síntesis de purinas y aminoácidos, así como de genes que codifican parte de la maquinaria de competencia natural de la bacteria. El aumento de los niveles de glucosa en las vías respiratorias de pacientes que sufren enfermedades respiratorias crónicas facilita la proliferación de patógenos que metabolizan este azúcar. HiNT cataboliza glucosa mediante una fermentación asistida por respiración que conlleva la excreción de acetato, formato y succinato. En el Capítulo 3 de este trabajo, diseñamos, generamos y caracterizamos un panel de cepas mutantes que no producen acetato, formato o succinato mediante la inactivación de los genes ackA, pflA y frdA, respectivamente. La inactivación de ackA limitó la producción de acetato y el crecimiento bacteriano, y estimuló tanto la producción de lactato en anaerobiosis como la atenuación bacteriana in vivo. El acetato excretado estimuló la expresión de genes pro-inflamatorios en células de epitelio respiratorio en cultivo, lo que sugiere que el catabolismo de glucosa contribuye no sólo al crecimiento de HiNT sino también a la inmunomodulación del sistema respiratorio humano. La resistencia de H. influenzae a antibióticos β-lactámicos ha llevado a su inclusión en la lista de patógenos bacterianos para los que la OMS considera prioritaria la búsqueda y desarrollo de nuevos antimicrobianos. En el Capítulo 4 de este trabajo, desarrollamos y validamos un modelo metabólico de H. influenzae a escala genómica, que utilizamos como herramienta de escrutinio in silico de genes esenciales de este patógeno, para su explotación como dianas terapéuticas. Este modelo predijo la esencialidad de un gran número de genes implicados en la síntesis de lípidos. Nos centramos en la enzima FabH, que cataliza la condensación descarboxilativa de malonil-ACP y acil-CoA en la iniciación de la biosíntesis de ácidos grasos. Nuestro modelado computacional mostró la idoneidad de la interacción de la molécula ácido 1- (5- (2-fluoro-5- (hidroximetil) fenil) piridin-2-il) piperidin- 4-acético y la proteína FabH. Este inhibidor redujo la viabilidad bacteriana de forma dosisdependiente. El efecto inhibitorio observado fue variable entre aislados clínicos portadores de distintas variantes alélicas del gen fabH, e independiente de su expresión. El inhibidor empleado no generó sinergias, no favoreció el desarrollo de resistencias, y no alteró la dinámica de infección epitelial por HiNT, mostrado además un efecto protector frente a la infección por HiNT in vivo. En conjunto, este trabajo de Tesis Doctoral proporciona conocimiento nuevo sobre el papel del metabolismo bacteriano en la interacción HiNT-sistema respiratorio humano, que esperamos sea de utilidad en el desarrollo de estrategias anti-infectivas que mejoren el manejo clínico de las enfermedades infecciosas asociadas a este patógeno.Publication Open Access Innate immunity against small ruminant lentiviruses (SRLV): characterization of APOBEC3-derived restriction(2020) Pablo Maiso, Lorena de; Reina Arias, Ramsés; Andrés Cara, Damián de; Agronomía, Biotecnología y Alimentación; Agronomia, Bioteknologia eta Elikadura; Gobierno de Navarra / Nafarroako GobernuaEn esta tesis se han llevado a cabo los siguientes estudios: 1. Identificación y caracterización de la restricción por APOBEC3 ovino frente a los SRLV. Se han estudiado dos tipos celulares que muestran restricción natural frente a los SRLV, monocitos y macrófagos-M1, identificando la isoforma Z1 como la más expresada, entre las proteínas APOBEC3 ovinas. En la caracterización genética de A3Z1 se ha identificado una isoforma adicional resultante de splicing alternativo, también presente en el transcriptoma humano y que carece del dominio citidín desaminasa (A3Z1Tr) característico de este tipo de proteínas. La expresión de estas proteínas se induce tanto tras la incubación con IFN-ɣ como con la infección viral. Ambas son resistentes a la degradación por Vif de SRLV y pueden encapsidarse en los viriones. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha podido determinar que ambas proteínas pueden interactuar entre sí así como con Vif viral, a pesar de la resistencia que presentan a su degradación. La expresión endógena de A3Z1 en células en cultivo tipo fibroblasto (T-immortalized goat epitelial fibroblasts, TIGEF) tan solo ha sido posible empleando estrategias de expresión transitoria, ya que los intentos de expresión permanente resultaban en cultivos abortivos. Las células TIGEF que expresan A3Z1 muestran una menor producción de SRLV. Ensayos de infectividad de un solo ciclo (single cycle infection) con vectores virales basados en HIV-1, MLV y SIV indican que A3Z1 ovino es capaz de inhibir la infectividad de dichos vectores. El mecanismo de restricción parece implicar la actividad citidín desaminasa en el contexto GA/AA. En ambos casos, la co-expresión de la isoforma truncada mitiga la restricción, probablemente por competición estérica con la proteína nativa en el interior de los viriones. 2. Caracterización de las vías de degradación de APOBEC3. Se ha investigado la capacidad de A3Z1 de restringir la infección con estirpes de SRLV que codifican la proteína Vif. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha podido comprobar que CYPA y no CBF-β es el cofactor necesario para la degradación de las proteínas APOBEC3 ovinas, requisito esencial en el caso de A3Z1 y A3Z1Tr. Concentraciones altas de CYPA permiten la degradación de A3Z1 por parte de Vif en diferentes tipos celulares, promoviendo así la infección por lentivirus. Sin embargo, no se alcanzan los niveles basales de A3Z1 empleando inhibidores del proteasoma y la degradación se produce también en presencia de Vif mutado, incapaz de reclutar el complejo ubiquitín ligasa y degradar así proteínas por la vía proteasomal, abriendo la posibilidad a la existencia de vías alternativas que permitan degradar A3Z1. Tan solo la combinación de inhibidores del proteasoma junto con inhibidores de la autofagia conseguían restablecer los niveles basales de A3Z1 sugiriendo la implicación de ambas vías. Además, la inhibición de la autofagia parece perjudicar la infección por SRLV, sugiriendo que la inducción podría favorecerla. 3. Estimulación de la respuesta innata ovina a través de la infección con vectores virales basados en el virus murino Sendai. La infección de células ovinas con un vector viral basado en el virus Sendai que codifica la proteína verde fluorescente (SeV-GFP) ha resultado ser del 100%, incluso en macrófagos de distintos orígenes. Sin embargo, la infección con SeV-GFP no se transmite en células ovinas y el vector es no replicativo. La infección con SeV-GFP ha activado una programación diferente dependiendo del tipo celular ovino, siendo la inducción de A3Z1 en células mieloides de especial importancia. La infección con SRLV y la producción de virus se encontraba disminuida en estas células tras el tratamiento con el vector viral. Los sobrenadantes procedentes de estos cultivos eran capaces de transmitir la restricción a células frescas, probablemente debido a la producción de interferón de tipo 1, sugiriendo que podría ser de utilidad en futuras estrategias de inmunización. La restricción también se ha observado frente a vectores basados en lentivirus, como HIV o SIV.