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Integrative approaches for the analysis of abiotic stress responses in the legume-Rhizobium symbiosis: from shoots to roots

La actual población mundial junto con las predicciones de un mayor crecimiento sugieren que es necesario incrementar el rendimiento de los cultivos a nivel mundial. Las leguminosas son el segundo cultivo más importante para alimentación después de los cereales, y gracias a su capacidad de establecer una relación simbiótica con bacterias del suelo, se reduce el impacto del uso de fertilizantes nitrogenados sobre el medio ambiente. Esta simbiosis da lugar al proceso conocido como fijación biológica de nitrógeno (FBN), que consiste en la reducción de nitrógeno molecular a amonio, a partir del cual, las plantas sintetizan compuestos orgánicos nitrogenados esenciales para su nutrición. Desafortunadamente, la FBN es un proceso muy sensible a estreses bióticos y abióticos tales como salinidad, sequía o limitación de nutrientes, entre otros. El objetivo general de este trabajo es ampliar los conocimientos sobre la regulación de la FBN y los mecanismos fisiológicos y bioquímicos que activan las plantas en respuesta a estreses abióticos. Para contrarrestar los efectos negativos de estreses osmóticos, las plantas y las bacterias son capaces de sintetizar compuestos osmoprotectores para mantener la viabilidad de las células, por ejemplo, el aminoácido prolina. El primer paso clave para entender las múltiples funciones de esta molécula bajo situaciones de estrés osmótico es una monitorización del uso de prolina a tiempo real. En el capítulo uno nuestros resultados mostraron que, en bacteroides, la acumulación de prolina no ocurre durante la fase de estrés, si no durante la recuperación, una vez las condiciones óptimas para el crecimiento de la planta se han reestablecido. En el capítulo dos, se llevó a cabo un estudio proteómico y metabólico dirigido para ampliar el conocimiento sobre el metabolismo de aminoácidos en nódulos de guisante. En el modelo clásico de intercambio de nutrientes entre simbiontes, la planta suministra energía en forma de dicarboxilatos a los bacteroides fijadores de nitrógeno a cambio de amonio. Sin embargo, este modelo clásico fue cuestionado por la observación de que las mutaciones en los transportadores de aminoácidos ABC, AapJQMP and BraDEFGC, en Rhizobium leguminosarum dieron lugar a síntomas de falta de nitrógeno en plantas tanto de guisante como de alubia. Se encontró que era esencial la absorción de aminoácidos de cadena ramificada (AACRs) para una efectiva FBN, al menos en especies de R. leguminosarum. Otro enfoque experimental para comprender mejor el papel del metabolismo de los aminoácidos en los nódulos es la aplicación de compuestos que inhiben la biosíntesis de AACRs en las células de las plantas tales como los herbicidas del grupo B. Estos enfoques nos permitieron verificar como la inhibición del transporte de AACRs entre simbiontes tuvo un mayor efecto en el metabolismo nodular que la inhibición de la biosíntesis de AACRs. De hecho, la biosíntesis de AACRs fue también inhibida debido a la doble mutación de aap/bra. En el capítulo dos, también evaluamos el efecto del estrés hídrico sobre el proteoma nodular, ya que entre las estrategias que usan las plantas en respuesta a estreses abióticos hay varias relacionadas con el metabolismo de aminoácidos. Este estudio destaca la relevancia de aminoácidos poco abundantes, como metionina, aminoácidos aromáticos o el ácido γ-aminobutírico, en la respuesta al estrés hídrico. Finalmente, hasta ahora no se ha intentado llevar a cabo un enfoque integral en el que se analicen los posibles cambios causados por sequía en la distribución de carbono (C) y, además, se analice el efecto sobre el consumo o la acumulación de metabolitos en todos los órganos de la planta. Con este propósito, en el capítulo tres, se analizó el efecto de la sequía tanto en la distribución de [U-13C]-sacarosa como en el contenido ureidos, ácidos orgánicos y carbohidratos. Descubrimos que la sequía disminuyó el transporte de 13C a los tejidos sumidero y cambió la prioridad en la distribución de C entre los órganos sumideros.

The current world population together with the predictions of further growth suggest that it is necessary to increase crop yields worldwide. Legumes are the second most important food crop after cereals, and thanks to their ability to establish a symbiotic relationship with soil bacteria, the impact of the use of nitrogen fertilizers on the environment is reduced. This symbiosis gives rise to the process known as biological nitrogen fixation (BNF), which consists in the reduction of molecular nitrogen to ammonium, from which plants synthesize organic nitrogenous products essential for their nutrition. Unfortunately, BNF is a very sensitive process to biotic and abiotic stresses such as salinity, drought, or nutrient limitation, among others. The general aim of this work was to gain further insights in the regulation of BNF and the physiological and biochemical mechanisms that plant activate in response to abiotic stresses. In order to counteract the negative effects of osmotic stresses, plant and bacteria are able to synthesise osmoprotectant compounds to maintain cell viability, e.g. the amino acid proline. A real-time monitoring of proline utilisation in both plant and bacterial systems is a first key step towards understanding the multiple roles of this molecule under osmotic stress situations. Our results in chapter one showed that, in bacteroids, proline accumulation does not occur during the stress phase, but during recovery, once optimal plant growth conditions are re-established. In chapter two, a proteomic and metabolic study was performed to gain further insights about amino acid metabolism in pea nodules. In the classical model of nutrient exchange between symbionts, plant supplies energy in the form of dicarboxylates to the N2-fixing bacteroids in exchange for ammonium. However, this classic model was challenged upon the observation that mutations in the general ABC amino-acid transporters AapJQMP and BraDEFGC in Rhizobium leguminosarum resulted in N starvation symptoms in both pea and bean plants. The uptake of branched-chain amino acids (BCAAs) from the plant by the bacteroid was found to be essential for an effective BNF at least in R. leguminosarum species. Another experimental approach to further understand the role of amino acid metabolism in nodules is the application of compounds that inhibit the biosynthesis of BCAAs in plant cells such as group B herbicides. These approaches allowed us to verify how the blockage of BCAA transport between symbionts had a greater effect on nodule metabolism than the inhibition of BCAA biosynthesis. In fact, BCAA biosynthesis was also inhibited due to the aap/bra double mutation. In chapter two, we also evaluate the effect of water deficit on nodule proteome, since among the strategies that plants use in response to abiotic stresses there are several related to amino acid metabolism. This study highlights the relevance of low abundant amino acids, such as methionine, aromatic amino acids or γ-aminobutyric acid, in the response to water deficit. Finally, until now no attempt has been made to carry out an integral approach in which possible changes caused by drought in carbon (C) allocation, and in addition, the effect on the consumption or accumulation of metabolites in all plant organs be analysed. For this purpose, in chapter three, the effect of drought on both the [U-13C]-sucrose distribution and ureides, organic acids and carbohydrates content were analysed. We found that drought decreased 13C transport to sink tissues and changed the priority of C allocation between sink organs.